Varilla de origami de ADN para filamentos gruesos de ingeniería
Las varillas de origami de ADN se diseñaron utilizando el software caDNAno43 (Fig. Suplementaria 1). Para plegar la varilla de origami de ADN, se mezclaron 50 nM de andamio (p8064, tilibit nanosystems) con 500 nM de grapas de núcleo. Los oligonucleótidos se obtuvieron de Hokkaido System Science o IDT. La reacción de plegado se llevó a cabo en tampón de plegado (5 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA y 18 mM MgCl2) con un calentamiento rápido hasta 80 °C y un enfriamiento en pasos de un solo grado hasta 60 °C durante 2 h, seguido de un enfriamiento adicional en pasos de un solo grado hasta 25 °C durante otras 72 h. Una lista completa de todas las secuencias de oligonucleótidos puede encontrarse en los Datos complementarios 2.
Las varillas de origami de ADN plegadas se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de glicerol según Lin et al.44. Brevemente, se hicieron soluciones de glicerol en gradiente del 15-45% (v/v) en tampón TE de 1 × que contenía 18 mM de MgCl2, y las fracciones de glicerol que contenían varillas de origami de ADN monomérico se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La concentración de las varillas de ADN origami se determinó mediante un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific), y la solución se alicuotó y se almacenó a -80 °C hasta su uso.
Diseño de la construcción
Para el subfragmento-1 (S1) de la construcción de miosina, se truncó el ADNc de la miosina IIa del músculo esquelético humano (Kazusa Product ID FXC25901) en Ala849. Este fragmento incluía el dominio motor, el dominio de unión a cadenas ligeras esenciales (ELC) y el dominio de unión a cadenas ligeras reguladoras (RLC). Para el etiquetado con oligonucleótidos y la purificación de la proteína, se adjuntaron en el C-terminal la etiqueta SNAP (New England Biolabs Inc.), la etiqueta FLAG y 6 × His. Se mantuvieron dos aminoácidos (Leu-Glu) correspondientes al sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (XhoI: CTCGAG) entre la etiqueta SNAP y la etiqueta FLAG. Para la construcción nula de la cadena ligera (S1 sin brazo de palanca), se eliminaron los sitios de unión ELC y RLC (Lys786-Leu846) de la construcción S1. Estos fragmentos de miosina se introdujeron aguas abajo del sitio de clonación múltiple del vector pShuttle-CMV (Agilent Technologies). Para el dominio de unión a actina de la construcción de α-actinina, se truncó el ADNc de α-actinina 1 humana (Addgene; pEGFP-N1 alpha-actin1) en el dominio de unión a actina (Asp1-Ala247). Para el etiquetado con oligonucleótidos y la purificación de la proteína, se adjuntaron etiquetas SNAP y 6 × His en el C-terminal mediante enlazadores (3 a.a., GGL). Este fragmento de α-actinina1-SNAP-His se introdujo aguas abajo del promotor T7 del plásmido pET T7-7 (Addgene).
Expresión y purificación de la proteína
Miosina IIa S1 humana y S1 sin palanca: Los adenovirus recombinantes se produjeron utilizando el sistema de vectores adenovirales AdEasy XL (Agilent Technologies). Los adenovirus producidos se purificaron utilizando el kit de purificación de virus AdEasy (Agilent Technologies). La expresión y purificación de la miosina recombinante se realizó de acuerdo con un estudio anterior31. Brevemente, los mioblastos murinos C2C12 (RIKEN Cell Bank) se cultivaron en DMEM (alta glucosa, Nacalai tesque) suplementado con 10% de FBS (Gibco) y 1% de Penicilina/Estreptomicina (Nacalai tesque). Para inducir la diferenciación en miotubos, las células se cultivaron hasta la confluencia, y el medio se sustituyó por DMEM suplementado con 2% de suero de caballo (Gibco) y 1% de Penicilina/Esteptomicina. Cuarenta y ocho horas después de la diferenciación, las células se infectaron con 1 × 106-8 unidades formadoras de placas de virus. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el medio se cambió de nuevo a medio de crecimiento. Tras 3-5 días de cambio de medio, las células se lavaron con PBS y se recogieron por raspado celular. A continuación, las células se lisaron con un homogeneizador de rebote y se centrifugaron. La miosina recombinante se purificó a partir del lisado clarificado utilizando el sistema de purificación AKTA de la siguiente manera (GE Healthcare). En primer lugar, la miosina se purificó mediante la purificación por afinidad de His-tag con una columna de níquel-sefarosa HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare). La solución de miosina eluida se dializó durante la noche a 4 °C en un tampón de baja salinidad (25 mM de imidazol, pH 7,0, 10 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 1 mM de DTT). Finalmente, la miosina recombinante se purificó en una columna de intercambio aniónico HiTrap Q HP de 1 ml (GE) utilizando un gradiente lineal de NaCl de 0-1 M.
Para preparar el dominio de unión a actina de la α-actinina, en primer lugar, el plásmido pET T7-7 que contiene la secuencia de α-actinina se transformó en la cepa E.coli Rosetta (DE3). El medio LB con 100 μg mL-1 de ampicilina se inoculó con células Rosetta precultivadas y luego se incubó a 37 °C. La sobreexpresión de α-actinina se indujo mediante la adición de isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM cuando la DO600 alcanzó 0,6-0,8. Las células se cultivaron durante la noche a 16 °C. Las células se cosecharon por centrifugación (50.000 × g a 4 °C durante 30 minutos), se resuspendieron en tampón fosfato sódico 25 mM pH 7,6, 150 mM NaCl, 10 mM β-Me, e inhibidor de proteínas (PI) (Thermo:Halt™ Protease Inhibitor Cocktail, sin EDTA (100 × )) y se almacenaron a -20 °C. Las células congeladas se descongelaron y luego se lisaron por sonicación. Se añadieron Tritón X-100 y polietilenimina a concentraciones finales del 1% y 0,05%, respectivamente. Tras 30 minutos en hielo, se eliminaron los restos celulares mediante centrifugación a 50.000 × g, 4 °C durante 30 minutos Se añadió imidazol al sobrenadante clarificado para obtener una concentración final de 10 mM. Se añadieron resinas de afinidad con metales TALON (Clontech) equilibradas con tampón normal (tampón de fosfato sódico 25 mM (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 10 mM de β-Me) a la solución de proteína α-actinina extraída y se incubaron durante 30 min a 4 °C para unirlas a las etiquetas de histidina. Las proteínas unidas de forma inespecífica se eliminaron con tampón de lavado (tampón normal con 10 mM de imidazol y PI). Las proteínas de α-actinina se eluyeron con tampón de elución (tampón normal que contenía 100 mM de imidazol y PI).
Etiquetado de oligonucleótidos
Las reacciones de etiquetado de oligonucleótidos para la miosina II se realizaron justo después de la purificación por intercambio aniónico. Los oligonucleótidos de ADN modificados con amina (NH2/GTGATGTAGGTGTAGAGGAA) (Hokkaido System Science) se unieron al sustrato SNAP, bencilguanina (BG; NEB), y 15-25 μM de oligonucleótidos BG se marcaron con ~1 μM de miosina II que contenía una etiqueta SNAP C-terminal (NEB) en tampón de elución de intercambio aniónico durante 30 minutos a temperatura ambiente. La miosina II marcada con oligonucleótidos se purificó por afinidad con el filamento de actina, se alicuotó y se almacenó a -80 °C hasta su uso. La eficiencia del etiquetado de los oligonucleótidos a la miosina II se estimó mediante un ensayo de desplazamiento de gel (gel de gradiente del 4-15%, Biorad) y se determinó como >99% tanto para S1 como para S1 sin brazo de palanca (Fig. Suplementaria 2).
Las reacciones de etiquetado de oligonucleótidos para la α-actinina se llevaron a cabo justo después de la purificación por afinidad del His-tag. El sustrato SNAP, los oligonucleótidos de ADN modificados por BG (TGGATATGGTGAGAGGAG/BG) se prepararon como se describió en la preparación de la miosina anteriormente, y se etiquetaron 15-25 μM de oligonucleótidos BG con ~1 μM de α-actina que contenía una etiqueta SNAP C-terminal en el tampón de elución de afinidad His-tag durante 30 min a temperatura ambiente. La α-actinina marcada con oligonucleótidos se purificó mediante una columna de intercambio aniónico (HiTrapQ HP), se alicuotó y se almacenó a -80 °C hasta su uso. La eficiencia del marcaje de los oligonucleótidos a la α-actinina se estimó mediante un ensayo de desplazamiento en gel (gel de gradiente 4-15%, Biorad) y se determinó como >95%.
Conjugación ADN-GNP
Las GNPs de cuarenta nanómetros (British BioCell International) se resuspendieron y se incubaron durante la noche en una solución de Bis (p-sulfonatofenil)fenilfosfina dihidratada dipotásica (BSPP) (Sigma-Aldrich) mientras se agitaba suavemente para estabilizar las GNPs a altas concentraciones de partículas45. Para realizar una conjugación rápida, seguimos un protocolo de conjugación asistida por pH46,47 como sigue. Las GNPs de 0,15 nM se concentraron 15 veces por centrifugación a 5000 × g durante 10 min. Se trató el oligonucleótido tiolado de 400 μM (correspondiente a ‘tiol/TTTTTTTTT’) con fosfina de Tris(2-carboxietil) 100 mM (TCEP, Sigma-Aldrich) y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad). La purificación en columna se realizó tres veces. A las GNP concentradas se les añadió un exceso de oligonucleótido de 4.800 veces. Se añadió tampón Citrato-HCl (pH = 3) hasta una concentración final de 10 mM. Tras 10 minutos de incubación, se añadió tampón Hepes 1 M (pH = 7) hasta una concentración final de 100 mM. Las GNPs conjugadas con ADN se almacenaron a 4 °C.
Conjugación de varilla de origami de ADN con miosina-GNP
Antes de la observación, las GNPs conjugadas con ADN se separaron de una cantidad excesiva de oligonucleótido mediante filtros de 100 kDa MWCO (Amicon Ultra, MERCK) con tampón TE añadido al filtro. La filtración se realizó cuatro veces. Las GNP conjugadas con ADN se resuspendieron finalmente en tampón TE con 11 mM de MgCl2, de modo que la concentración final de las GNP fue de ~1 nM. Las GNPs de ADN purificadas, las varillas de origami de ADN, los dominios de unión a actina de α-actinina y las miosinas se mezclaron en una proporción molar de ~1:1:80:50 y se incubaron al menos durante 1 h.
Preparación de la muestra para la obtención de imágenes de GNP
Los experimentos de obtención de imágenes de GNP se realizaron dentro de una cámara de flujo montada con un vidrio recubierto de diclorodimetilsilano (DDS)48 de la siguiente manera. Los cubreobjetos se limpiaron mediante plasma a baja presión durante 3 minutos con un sistema de plasma (Zepto, Diener electronic, Alemania). Después de enjuagar con acetona, los cubreobjetos se sumergieron en acetona durante 20 minutos con sonicación y luego en etanol durante otros 20 minutos con sonicación. Tras enjuagar con Milli-Q, los cubreobjetos se sonicaron en 1 M KOH durante 1 h. Tras sonicar de nuevo en acetona y etanol, los cubreobjetos se sonicaron en 5 M KOH durante 1 h. Los cubreobjetos se enjuagaron con MilliQ y se secaron con un soplador de aire. Después de enjuagar con hexano, los cubreobjetos se colocaron en hexano con DDS al 0,1% durante 1,5 horas con una agitación suave. Después de enjuagar con hexano, los cubreobjetos se sonicaron en hexano durante 1 minuto, se secaron con un soplador de aire y se almacenaron a -30 °C en condiciones secas. La cámara de flujo se montó intercalando dos trozos de cinta adhesiva de doble cara entre un cubreobjetos no tratado y un cubreobjetos recubierto con DDS.
Para preparar una muestra de observación, después de lavar la cámara con tampón de ensayo (5 mM HEPES-NaOH pH 7,8, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 500 μM EGTA), se añadió a la cámara 0,2 mg ml-1 de BSA biotinilada (ThermoFisher) y se incubó durante 3 min. Después de lavar con tampón de ensayo, se añadió 0.Se añadió a la cámara un 2% de Tween-20 (Sigma-Aldrich) y se incubó durante 10 minutos. Se añadieron a la cámara, en serie, 0,2 mg ml-1 de solución de NeutraAvidina (ThermoFisher), 5 μg ml-1 de filamento de actina biotinilado al 20% y ~100 pM de ADN de varilla de origami-Miosina-GNP mientras se lavaba la cámara con tampón de ensayo. A continuación, se incubó la cámara durante 3 minutos con tampón de imagen (0,11 mg ml-1 de glucosa oxidasa, 18 μg ml-1 de catalasa, 2,3 mg ml-1 de glucosa y 0,5% de 2-mercaptoetanol en tampón de ensayo), incluyendo el ATP, que se selló con esmalte de uñas y se observó al microscopio a 27 ± 1 °C. Las trayectorias se analizaron utilizando la inferencia bayesiana no paramétrica (Fig. 6a) sobre los datos de los experimentos realizados a 19 ± 0,5 °C. En los experimentos con ATP fluorescente, se añadió 2′/3′-O-(2-aminoethyl-carbamoyl)-adenosina-5′-trifosfato (Jena Bioscience) marcado con Cy3 al tampón de obtención de imágenes en lugar de ATP.
Microscopía de campo oscuro de tipo objetivo evanescente
La obtención de imágenes de PNB se realizó con un sistema MicroMirror TIRF (Mad City Labs)37,49. En la Fig. 3 complementaria se muestra un esquema del montaje óptico. La iluminación fue proporcionada por un láser de 532 nm (2 W de potencia nominal, Coherent Genesis CX) y enfocada en el plano focal posterior del objetivo (Olympus, ×60, NA = 1,49, aceite) por una lente de 250 mm de distancia focal a través de un microespejo. El láser de retorno se dirigió a un fotodiodo cuadrante y se utilizó en un sistema de autoenfoque (TIRF Lock, Mad City Labs). La densidad de potencia medida en la muestra fue de ~2,5 kW cm-2 al máximo en los experimentos. Teniendo en cuenta que el aumento de la temperatura provoca la absorción de la luz por parte del GNP50, concluimos que el efecto del calentamiento es insignificante. Las imágenes de dispersión y fluorescencia se separaron mediante un espejo dicroico (FF562-Di02-25 × 36) y se adquirieron con cámaras CMOS a 25.000 fps, 123 nm por píxel y 384 × 256 píxeles por cuadro (FASTCAM mini AX100, Photoron), y a 200 fps, 160 nm por píxel y 1024 × 512 píxeles por cuadro (ORCA-Flash4.0, Hamamatsu photonics). Se colocó un filtro de emisión (FF01-593/40-25) en la trayectoria fluorescente. La imagen fluorescente se utilizó para observar el ATP fluorescente (Fig. 5). Para medir los tiempos de espera del ATP (Fig. Suplementaria 6a, b), se adquirieron imágenes a 1000 fps mediante AX100.
Análisis de datos de imágenes
Las imágenes de GNP se localizaron rápidamente por simetría radial basándose en el método de localización de partículas51 (el software está disponible en la referencia) y se examinaron para excluir las GNP que mostraban un comportamiento imprevisible a partir de la geometría del complejo (Fig. Suplementaria 5). Consideramos que las GNP excluidas se unían de forma inespecífica a la superficie del vidrio o no se unían firmemente al complejo ADN-varilla de origami-miosina-actina. Tras el cribado, las GNP se localizaron mediante el ajuste de la distribución gaussiana20, y la trayectoria en la dirección del eje mayor se analizó mediante un método de inferencia que utilizaba un modelo oculto de Markov39 asumiendo dos estados (estados de unión y de desprendimiento). Estimamos el desplazamiento causado por el proceso de generación de actomiosina a partir de la distancia inferida entre los dos estados (Fig. 4d).
Para evaluar los estados ocultos en el estado de desprendimiento, utilizamos la inferencia bayesiana no paramétrica basada en un modelo de Markov oculto41, que es capaz de detectar estados moleculares ocultos sin definir el número de estados de antemano. Descargamos y utilizamos archivos de Matlab, especialmente «iHmmNormalSampleBeam.m», con los siguientes supuestos. En primer lugar, la trayectoria de cada estado se distribuía normalmente. En segundo lugar, asumimos un estado separado e infinitos estados de unión, y que los estados de unión comparten la misma distribución de emisión. Las desviaciones estándar de las dos distribuciones de emisión del estado separado y de los estados de unión se fijaron en 12,5 nm y 4,7 nm, respectivamente. Los valores fijados se obtuvieron calculando las desviaciones estándar de todos los puntos y los puntos de los estados de unión fuerte en las trayectorias analizadas. Los datos utilizados para la inferencia incluían 10.000 puntos (400 ms). La probabilidad de una transición de un estado de unión a otro estado de unión se fijó en 0. Los estados inferidos cuyos puntos eran <1% de las trayectorias analizadas o tenían tiempos de permanencia <40 μs fueron excluidos del análisis. Finalmente, las posiciones de los estados de unión inferidos se definieron como las posiciones relativas desde la posición de desprendimiento inferida. Realizamos la inferencia 1000 veces, en las que la iteración del algoritmo Markov chain Monte Carlo se fijó en 1000 (Fig. 6a). Entre los estados inferidos, los estados cuyas posiciones estaban dentro de los picos ± 1 SD se utilizaron para calcular la accesibilidad y el tiempo de permanencia en la Fig. 7a. Para comprobar la exactitud de la detección, produjimos datos simulados asumiendo 4 u 8 estados de unión transitoria y un estado separado con las desviaciones estándar (12,5 nm y 4,7 nm) obtenidas de los datos experimentales como se ha descrito anteriormente.
Se analizó el curso temporal de la intensidad de fluorescencia de Cy3-EDA-ATP para calcular el tiempo de espera del ATP. Brevemente, el curso temporal se adquirió promediando la intensidad de una región de interés (ROI) de 7 × 7 píxeles en cada fotograma. El centro de la ROI fue definido por la imagen de dispersión del GNP unido a una miosina. Se realizó una corrección del ruido de fondo calculando la intensidad media del perímetro alrededor de la ROI52. Se midió el tiempo de encendido ajustando los datos a un decaimiento exponencial doble y se definió la tasa más lenta como la tasa de unión del ATP, dando así un ciclo completo de la ATPasa53. La tasa de unión de ATP de Cy3-EDA-ATP se corrigió con respecto a la tasa de ATP normal por un factor de 2,854.
Preparación de bicapas lipídicas con soporte de mica
Las vesículas lipídicas se prepararon a partir de un stock de cloroformo de compuestos lipídicos mezclándolos en un tubo de vidrio. Una composición lipídica típica era 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP) en una proporción de peso de 0,98:0,02. En algunos casos, el contenido del lípido cargado positivamente DPTAP se incrementó hasta el 10%. El cloroformo se evaporó en un desecador de vacío durante al menos 30 min. Los lípidos se suspendieron en agua Milli-Q (concentración total de lípidos 1 mg/ml). La suspensión de lípidos se agitó en vórtex y se sonicó para producir vesículas lipídicas multilamelares.
Las bicapas lipídicas soportadas (SLBs) se prepararon a partir de vesículas lipídicas mediante el método de fusión de vesículas55. Las vesículas lipídicas se diluyeron a 0,25 mg ml-1 añadiendo una solución de MgCl2 de 10 mM. La solución de vesículas se sonicó para obtener pequeñas vesículas unilamelares. Los SLB se formaron depositando 2 µl de solución de vesículas sobre mica recién cortada en una platina de vidrio (diámetro, 1,5 mm) y se incubaron durante 10 minutos a 60 °C. Para evitar que la muestra se secara, se incubó en un recipiente sellado, en cuyo interior se introdujo un trozo de Kimwipe humedecido con agua Milli-Q.
Preparación de la muestra para la obtención de imágenes de AFM
Se incubaron varillas de ADN (10 nM) y miosina-oligonucleótidos (1 µM) durante 30 min a 4 °C para formar conjugados de varillas de miosina-ADN por adelantado. Tras enjuagar el sustrato de bicapa lipídica con agua Milli-Q y tampón A (10 mM HEPES-NaOH (pH 7,8), 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM EGTA) para eliminar las vesículas no adsorbidas, se depositó una gota (2 µl) de conjugados de barras de miosina-ADN en tampón A sobre las bicapas lipídicas durante 5 min en una campana húmeda. Después de enjuagar con la solución tampón A, se depositó una gota (2 µl) de filamentos de actina (1 µM) en la solución tampón A sobre las bicapas lipídicas durante 10 minutos en una campana húmeda. Después de enjuagar con una solución que contenía ATP (adenosina 5′-trifosfato, P3-(1-(2-nitrofenil) éster) (Invitrogen) (0-1 µM) en tampón A, la muestra se acopló a la platina de barrido de un aparato HS-AFM y se sumergió en la misma solución (120 µl).
Imágenes de AFM de alta velocidad
Las imágenes de AFM se realizaron utilizando un sistema de HS-AFM (NanoExplorer, RIBM, Tsukuba, Japón) con un cantilever de nitruro de silicio (frecuencia de resonancia, 1,5 MHz en aire, constante de resorte, 0,1 N m-1; Olympus BL-AC10DS-A2). Los conjugados de varilla de miosina-ADN y los filamentos de actina se adsorbieron débilmente de forma lateral en la superficie del sustrato que contenía DPTAP. Para obtener imágenes de alta resolución de los conjugados de barras de miosina-ADN en presencia de ATP, se redujo el área de exploración (normalmente a unos 300 × 150 nm2) y se optimizó el número de píxeles (100 × 50 píxeles). El ATP enjaulado se fotolizó utilizando una fuente de luz de lámpara de mercurio (U-RFL-T, Olympus) y un filtro de trayectoria de banda (FF01-360/23-25, Semrock) durante la observación durante 30 s de media. La velocidad media de deslizamiento de los filamentos de actina en los experimentos de AFM con 1 µM de ATP enjaulado fue de 1,4 nm s-1. A juzgar por la velocidad de deslizamiento de la actina en nuestro ensayo de motilidad in vitro, la concentración final de ATP en los experimentos de AFM se estimó en unos 190 nM. Las imágenes de AFM se analizaron utilizando el software Eagle (RIBM, Tsukuba, Japón) e ImageJ. Todas las observaciones se realizaron a temperatura ambiente.
Aplicamos a cada imagen de AFM un filtro gaussiano para eliminar los ruidos de los picos y un filtro de aplanamiento para eliminar el efecto de inclinación del sustrato. Cada posición del dominio motor de miosina se determinó calculando el centro de masa para medir el desplazamiento.
Estadística y reproducibilidad
Para los experimentos de imagen de alta velocidad y los experimentos de AFM, hemos realizado los experimentos al menos tres veces de forma independiente para obtener los resultados consistentes. Los tamaños de los pasos de S1 sin palanca y de tipo salvaje se analizaron estadísticamente mediante pruebas t de student de dos colas. El número de experimentos independientes, el nombre de la prueba estadística, el tamaño del efecto y los valores p exactos se indican en la leyenda de cada figura. El tamaño del efecto (g de Hedges) se calculó mediante el código MATLAB descargado de la referencia56. Consideramos que un valor p < 0,05 es una diferencia significativa entre las medias. El rango de valores p se muestra con asteriscos en los gráficos como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001.
Resumen del informe
Puede obtenerse más información sobre el diseño de la investigación en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.
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