Objetivos:

1. Estudiar las diferentes fases del crecimiento bacteriano.
2. Trazar la curva de crecimiento estándar de Staphylococcus aureus.
3. Determinar el tiempo de generación de una bacteria determinada.

El aumento del tamaño y la masa celular durante el desarrollo de un organismo se denomina crecimiento. Es la característica única de todos los organismos. El organismo debe requerir ciertos parámetros básicos para su generación de energía y biosíntesis celular. El crecimiento del organismo se ve afectado por factores físicos y nutricionales. Los factores físicos incluyen el pH, la temperatura, la presión osmótica, la presión hidrostática y el contenido de humedad del medio en el que crece el organismo. Los factores nutricionales incluyen la cantidad de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros oligoelementos proporcionados en el medio de crecimiento. Las bacterias son organismos unicelulares (una sola célula). Cuando las bacterias alcanzan un determinado tamaño, se dividen por fisión binaria, en la que una célula se divide en dos, dos en cuatro y continúan el proceso de forma geométrica. Se sabe entonces que la bacteria está en fase de crecimiento activo. Para estudiar la población de crecimiento bacteriano, las células viables de la bacteria deben inocularse en el caldo estéril e incubarse en condiciones óptimas de crecimiento. La bacteria comienza a utilizar los componentes del medio y aumentará su tamaño y masa celular. La dinámica del crecimiento bacteriano puede estudiarse trazando el crecimiento celular (absorbancia) frente al tiempo de incubación o el logaritmo del número de células frente al tiempo. La curva así obtenida es una curva sigmoidea y se conoce como curva de crecimiento estándar. El aumento de la masa celular del organismo se mide utilizando el espectrofotómetro. El espectrofotómetro mide la turbidez o la densidad óptica, que es la medida de la cantidad de luz absorbida por una suspensión bacteriana. El grado de turbidez en el cultivo de caldo está directamente relacionado con el número de microorganismos presentes, ya sean células viables o muertas, y es un método conveniente y rápido para medir la tasa de crecimiento celular de un organismo. Así, el aumento de la turbidez del medio del caldo indica el aumento de la masa celular microbiana (Fig. 1). La cantidad de luz transmitida a través del caldo turbio disminuye con el consiguiente aumento del valor de absorbancia.

Fig 1: Lectura de la absorbancia de la suspensión bacteriana

La curva de crecimiento tiene cuatro fases distintas (Fig 2)

1. Fase de retardo

Cuando un microorganismo se introduce en el medio fresco, tarda un tiempo en adaptarse al nuevo entorno. Esta fase se denomina fase de retardo, en la que el metabolismo celular se acelera, las células aumentan de tamaño, pero las bacterias no son capaces de replicarse y, por tanto, no aumenta la masa celular. La duración de la fase de retardo depende directamente de las condiciones previas de crecimiento del organismo. Cuando el microorganismo que crece en un medio rico se inocula en un medio nutricionalmente pobre, el organismo tardará más tiempo en adaptarse al nuevo entorno. El organismo empezará a sintetizar las proteínas, coenzimas y vitaminas necesarias para su crecimiento y, por lo tanto, se producirá un aumento de la fase de latencia. Del mismo modo, cuando un organismo procedente de un medio nutricionalmente pobre se añade a un medio nutricionalmente rico, el organismo puede adaptarse fácilmente al entorno, puede iniciar la división celular sin ningún retraso y, por lo tanto, tendrá menos fase de retardo que puede estar ausente.

2. Fase exponencial o logarítmica (log)

Durante esta fase, los microorganismos se encuentran en un estado de rápido crecimiento y división. Su actividad metabólica aumenta y el organismo comienza la replicación del ADN por fisión binaria a un ritmo constante. El medio de crecimiento se explota al máximo, el cultivo alcanza la máxima tasa de crecimiento y el número de bacterias aumenta logarítmicamente (exponencialmente) y finalmente la célula única se divide en dos, que se replican en cuatro, ocho, dieciséis, treinta y dos y así sucesivamente (Es decir, 20, 21, 22, 23………2n, n es el número de generaciones) Esto dará lugar a un crecimiento equilibrado. El tiempo que tardan las bacterias en duplicar su número durante un periodo de tiempo determinado se conoce como tiempo de generación. El tiempo de generación tiende a variar con los diferentes organismos. E.coli se divide cada 20 minutos, por lo que su tiempo de generación es de 20 minutos, y para Staphylococcus aureus es de 30 minutos.

3. Fase estacionaria

A medida que la población bacteriana continúa creciendo, todos los nutrientes del medio de crecimiento son utilizados por el microorganismo para su rápida multiplicación. Esto da lugar a la acumulación de materiales de desecho, metabolitos tóxicos y compuestos inhibidores como los antibióticos en el medio. Esto modifica las condiciones del medio, como el pH y la temperatura, creando así un entorno desfavorable para el crecimiento bacteriano. La tasa de reproducción se ralentiza, el número de células que se dividen es igual al número de células muertas y, finalmente, la bacteria deja de dividirse por completo. El número de células no aumenta y, por tanto, la tasa de crecimiento se estabiliza. Si una célula tomada de la fase estacionaria se introduce en un medio fresco, la célula puede pasar fácilmente a la fase exponencial y es capaz de realizar sus actividades metabólicas como de costumbre.

4. Fase de declive o muerte

El agotamiento de nutrientes y la posterior acumulación de productos de desecho metabólicos y otros materiales tóxicos en el medio facilitará que la bacteria pase a la fase de muerte. Durante ésta, la bacteria pierde completamente su capacidad de reproducción. Las bacterias individuales comienzan a morir debido a las condiciones desfavorables y la muerte es rápida y a un ritmo uniforme. El número de células muertas supera al número de células vivas. Algunos organismos que pueden resistir esta condición pueden sobrevivir en el medio ambiente produciendo endosporas.

Fig 2: Diferentes fases de crecimiento de una bacteria

CÁLCULO:

El tiempo de generación se puede calcular a partir de la curva de crecimiento(Fig 3).

Fig 3: Cálculo del tiempo de generación

Se tomaron los puntos exactamente duplicados de las lecturas de absorbancia y, se extrapolaron los puntos para cumplir con el eje de tiempo respectivo.

Tiempo de generación = (Tiempo en minutos para obtener la absorbancia 0,4) – (Tiempo en minutos para obtener la absorbancia 0.2)

= 90-60

= 30 minutos

Dejemos que No = el número de población inicial

Nt = la población en el tiempo t

N = el número de generaciones en el tiempo t

Por tanto,

Por tanto,

La tasa de crecimiento puede expresarse en términos de la constante media de la tasa de crecimiento (k), el número de generaciones por unidad de tiempo.

Tiempo medio de generación o tiempo medio de duplicación (g) es el tiempo que se tarda en duplicar su tamaño.