Microscopio de luz- definición, principio, tipos, partes, aumento

Última actualización el 26 de enero de 2021 por Sagar Aryal

Historia de la microscopía: Visión general

• La evolución del campo de la Microbiología puso en perspectiva la necesidad de identificar, ver, observar y comprender los microorganismos, incluyendo sus morfologías y mecanismos estructurales. El ámbito de la Microbiología es el estudio de organismos y agentes diminutos que sólo pueden ser examinados y observados con un microscopio.
• Aunque científicamente, el primer microscopio simple fue descubierto por dos científicos holandeses, Zaccharias Janssen y su padre, Hans que fabricaba gafas, fueron los primeros en experimentar con sus lentes combinando lentes en un tubo y observaron que los objetos que estaban cerca, parecían más cercanos y grandes. A pesar de no ser incluido como un descubrimiento científico, este acto preparó el camino para la evolución científica.
• De la Historia de la Microbiología, Antony Van Lewnehoueek un Microbiólogo aficionado fabricó el primer microscopio simple, que le permitió observar la presencia de diminutos organismos vivos en el agua del estanque que aparecían como puntos. Su sencillo microscopio estaba formado por una doble lente de vidrio convexa que se sostenía entre dos placas de plata.
• La aplicación de la microscopía en Microbiología mejoró la visualización de las células y los microorganismos ampliando sus imágenes para hacerlas más grandes.

El microscopio de luz también se conoce como microscopio óptico.

¿Qué es un microscopio óptico?

• Un microscopio óptico es un instrumento o herramienta de laboratorio de biología, que utiliza la luz visible para detectar y aumentar objetos muy pequeños, y ampliarlos.
• Utilizan lentes para enfocar la luz sobre el espécimen, ampliándolo y produciendo así una imagen. El espécimen se coloca normalmente cerca de la lente del microscopio.
• El aumento del microscopio varía mucho según los tipos y el número de lentes que lo componen. Dependiendo del número de lentes, hay dos tipos de microscopios, es decir, el microscopio de luz simple (tiene poco aumento porque utiliza una sola lente) y el microscopio de luz compuesto (tiene un aumento mayor en comparación con el microscopio simple porque utiliza al menos dos juegos de lentes, una lente objetivo y un ocular). Las lentes están alineadas de forma que, pueden ser capaces de curvar la luz para una ampliación eficiente de la imagen.
• El funcionamiento del microscopio óptico se basa en su capacidad para enfocar un haz de luz a través de un espécimen, que es muy pequeño y transparente, para producir una imagen. A continuación, la imagen se hace pasar por una o dos lentes para ampliarla y poder verla. La transparencia de la muestra permite una penetración fácil y rápida de la luz. Los especímenes pueden variar desde bacterias hasta células y otras partículas microbianas.

Figura: Diagrama de microscopios de luz, creado con biorender.com
Principio de un microscopio de luz (microscopio óptico)
Como se ha mencionado anteriormente, los microscopios de luz visualizan una imagen mediante el uso de una lente de vidrio y el aumento se determina por, la capacidad de la lente para doblar la luz y enfocarla en el espécimen, lo que forma una imagen. Cuando un rayo de luz pasa a través de un medio a otro, el rayo se dobla en la interfaz causando refracción. La curvatura de la luz viene determinada por el índice de refracción, que es una medida de la medida en que una sustancia reduce la velocidad de la luz. La dirección y la magnitud de la curvatura de la luz están determinadas por los índices de refracción de los dos medios que forman la interfaz.
Un medio con un índice de refracción más bajo, como el vidrio al aire, normalmente acelera la penetración de la luz y hace que la luz se doble lejos de la normal y cuando la luz pasa a través de un medio con un índice de refracción mayor, como el aire al vidrio, normalmente se ralentiza y se dobla hacia la normal, perpendicularmente a la superficie.
Si se interpone un objeto entre estos dos medios, es decir, entre el agua y el aire, en este caso, un prisma, el prisma doblará la luz en un ángulo. Así es como funcionan las lentes microscópicas, que desvían la luz en un ángulo. La lente (convexa) al recibir los rayos de luz, los enfoca en un punto específico conocido como punto focal (punto F). La medida de la distancia entre el centro de la lente y el punto focal se conoce como distancia focal.
Un microscopio utiliza lentes cuya potencia está predeterminada, es decir, la potencia de una lente está directamente relacionada con la distancia focal, es decir, una distancia focal corta aumenta los objetos más que las lentes con una distancia focal larga.
La microscopía funciona estrictamente con un factor de resolución, siendo la resolución la capacidad de una lente para poder diferenciar objetos pequeños que están muy juntos. La resolución de un microscopio de luz viene determinada por la apertura numérica de su sistema de lentes y por la longitud de onda de la luz que emplea; la apertura numérica es una definición de las longitudes de onda de la luz que se produce cuando se ilumina la muestra.
Una distancia mínima (d) entre dos objetos que distingue entonces a ser dos entidades separadas, determinada por las longitudes de onda de la luz puede ser calculada por una ecuación de Abbe usando la longitud de onda de la luz que ilumina el espécimen (Lambda, λ) y la apertura numérica (NA, n sin Ɵ) i.e. d=0,5 λ/n sin Ɵ
Tipos de microscopios de luz (microscopio óptico)
Con la evolución del campo de la Microbiología, los microscopios que se utilizan para ver las muestras son tanto microscopios de luz simples como compuestos, todos ellos utilizando lentes. La diferencia es que los microscopios ópticos simples utilizan una sola lente para el aumento, mientras que los compuestos utilizan dos o más lentes para los aumentos. Esto significa, que una serie de lentes se colocan en un orden tal que, una lente aumenta la imagen más que la lente inicial.
Los tipos modernos de microscopios de luz incluyen:
1. Microscopio de luz de campo claro
2. Microscopio de luz de contraste de fase
3. Microscopio de luz de campo oscuro

.Microscopio de luz de campo claro

4. Microscopio de luz de fluorescencia
Microscopio de luz de campo claro (microscopio de luz compuesto)
• Es el Microscopio óptico más básico utilizado en los laboratorios de microbiología que produce una imagen oscura sobre un fondo brillante. Compuesto por dos lentes, se utiliza ampliamente para ver los orgánulos de las células vegetales y animales, incluyendo algunos parásitos como el Paramecium, después de la tinción con tinciones básicas.
• Su funcionalidad se basa en poder proporcionar una imagen de alta resolución, que depende en gran medida del uso adecuado del microscopio. Esto significa que una cantidad adecuada de luz permitirá enfocar suficientemente la imagen, para producir una imagen de calidad.
• También se conoce como microscopio de luz compuesta.

Partes de un microscopio de campo brillante (Microscopio de luz compuesta)



Figura creada con biorender.com

Se compone de:

• Dos lentes que incluyen la lente objetiva y el ocular o lente ocular.
• La lente objetiva se compone de seis o más vidrios, que hacen que la imagen sea clara del objeto
• El condensador está montado debajo de la platina que enfoca un haz de luz sobre el espécimen. Puede ser fijo o móvil, para ajustar la calidad de la luz, pero esto depende totalmente del microscopio.
• Se mantienen unidos por una robusta espalda metálica curvada que se utiliza como brazo y un soporte en la parte inferior, conocido como base, del microscopio. El brazo y la base sostienen todas las partes del microscopio.
• La platina donde se coloca el espécimen, permitiendo el movimiento del espécimen alrededor para una mejor visualización con las perillas flexibles y es donde se enfoca la luz.
• Dos perillas de enfoque i.e el mando de ajuste fino y el mando de ajuste grueso, que se encuentran en el brazo de los microscopios, que pueden mover la platina o el revólver para enfocar la imagen. la nitidez de la imagen.
• Tiene un iluminador de luz o un espejo que se encuentra en la base o en los microscopios del revólver.
• El revólver tiene alrededor de tres a cinco lentes objetivas con diferente poder de aumento. Se puede mover alrededor a cualquier posición dependiendo de la lente objetivo para enfocar la imagen.
• Un diafragma de apertura también se conoce como el contraste, que controla el diámetro del haz de luz que pasa a través del condensador, en que, cuando el condensador está casi cerrado, la luz viene a través del centro del condensador creando un alto contraste. Pero cuando el condensador está muy abierto, la imagen es muy brillante con un contraste muy bajo.

Ampliación por Microscopio de Campo Brillante (Microscopio de Luz Compuesta)

Durante la visualización, la lente objetivo permanece parfocal lo que significa, que cuando se cambia la lente objetivo, la imagen sigue estando enfocada. La lente del objetivo desempeña un papel importante en el enfoque de la imagen en el condensador formando una imagen clara ampliada dentro del microscopio, que luego es ampliada por el ocular a una imagen primaria.

Lo que se ve en el microscopio como una imagen clara ampliada del espécimen se conoce como la imagen virtual. Para calcular el aumento, hay que multiplicar los aumentos del objetivo y del ocular. El aumento es estándar, es decir, ni muy alto ni muy bajo, por lo que dependiendo de la potencia de aumento de las lentes, oscilará entre 40X y 100oX.

Cálculo del aumento = Aumento de la lente del objetivo/Aumento de la lente del ocular

La lente del objetivo juega un papel fundamental no sólo para ampliar la imagen, sino también para hacerla clara para su visualización, característica que se conoce como resolución. La resolución, según Prescott, es la capacidad de una lente para separar o distinguir entre objetos pequeños estrechamente vinculados entre sí.

Como el ocular amplía la imagen al final de la visualización, su rango de aumento es menor que el de la lente objetiva de 8X-12X (10X estándar) y el de la lente objetiva de 40X-100X, la ampliación, y la resolución del microscopio dependen en gran medida de la lente objetiva.

Aplicaciones del Microscopio de Luz de Campo Brillante (Microscopio de luz compuesto)

Muy utilizado en Microbiología, este microscopio se utiliza para ver muestras fijas y vivas, que han sido teñidas con tintes básicos. Esto proporciona un contraste para una fácil visibilidad bajo el microscopio. Por lo tanto, se puede utilizar para identificar células de bacterias básicas y protozoos parasitarios como el Paramecium.

Hoja de trabajo gratuita del microscopio óptico

Clave de respuestas



Microscopio de contraste de fases

• Se trata de un tipo de microscopio óptico en el que se producen pequeñas desviaciones de la luz, conocidas como cambios de fase, durante la penetración de la luz en la muestra no teñida. Estos cambios de fase se convierten en la imagen para significar, cuando la luz pasa a través del espécimen opaco, los cambios de fase aclaran el espécimen formando una imagen iluminada (brillante) en el fondo.
• El microscopio de contraste de fase produce imágenes de alto contraste cuando se utiliza un espécimen transparente más los de cultivos microbianos, fragmentos de tejido delgado, tejidos celulares y partículas subcelulares.
• El principio de funcionamiento del microscopio de contraste de fase es el uso de un método óptico para transformar un espécimen en una imagen de amplitud, que es vista por el ocular del microscopio.
• El PCM puede ser usado para ver células no teñidas también conocidas como los objetos de fase, lo que significa que la morfología de la célula se mantiene y las células pueden ser observadas en su estado natural, en alto contraste y eficiente claridad. Esto se debe a que si las muestras se tiñen y se fijan, matan a la mayoría de las células, una característica que se deshace de forma exclusiva con el microscopio de luz de campo claro.
• Los desplazamientos que se producen durante la penetración de la luz, se convierten en cambios de amplitud que provocan el contraste de la imagen.
• Acoplados a elementos potenciadores del contraste como la fluorescencia, producen una mejor visualización de la imagen de los especímenes.

Partes del Microscopio de Contraste de Fases

La instrumentación del Microscopio de Contraste de Fases se basa en sus vías de luz desde la recepción de la fuente de luz hasta la visualización de la imagen.

Por lo tanto su secuencialmente compuesto por:

• Fuente de luz (lámpara de arco de mercurio)
• Lente colectiva
• Apertura
• Condensador
• Condensador anular
• Espécimen
• Objetivo
• Placa de fase
• Luz reflejada
• Luz de contraste

.

• Anillo de fase

Funcionamiento del microscopio de contraste de fase

• El cambio que provoca la luz desviada dispersada (Desviada) y la luz no desviada que llega a la muestra que se absorbe, crea en una determinada longitud de onda, produciendo el color. La diferencia creada por la luz dispersa y la de la luz absorbida se conoce como variaciones de amplitud. Estas variaciones de amplitud son sensibles para permitir la visualización por equipos fotográficos como el Microscopio de Contraste de Fase, por lo tanto visto por el ojo humano.
• El Condensador del microscopio de contraste de fase tiene un disco opaco que se conoce como anillo anular, con un anillo transparente que produce un cono de luz, que pasa a través de un espécimen. Debido a las variaciones de la luz, una parte de la misma se desvía en el espécimen, a causa de las variaciones de la densidad de la luz, formando una imagen en la lente del objetivo. La luz no desviada incidirá en el anillo de fase de la placa de fase y la luz desviada no alcanzará el anillo de fase pasando por la placa de fase directamente, esto forma una imagen.

El microscopio de contraste de fase está diseñado con lentes objetivo que tienen la capacidad de realizar múltiples funciones cuando se combinan con técnicas de mejora del contraste, por ejemplo, la fluorescencia. Las lentes objetivas se encuentran en la placa de fase interna con variación en la absorción de la luz y el desplazamiento de la fase, es decir, la no difracción, creando un amplio espectro para contrastar el espécimen y formar un fuerte contraste en el fondo.

Aplicaciones del microscopio de contraste de fase

• Determinar morfologías de células vivas como las células vegetales y animales
• Estudiar la motilidad microbiana y las estructuras de locomoción
• Detectar ciertos elementos microbianos como las endosporas bacterianas

Microscopio deMicroscopio de luz de campo oscuro

Este es un tipo especializado de microscopio de luz de campo brillante que tiene varias similitudes con el Microscopio de contraste de fase. Para hacer un Microscopio de campo oscuro, se coloca un tope de campo oscuro debajo y una lente condensadora que produce un haz de luz de cono hueco que entra en el objetivo solamente, desde el espécimen (Prescott, pg 22).

Esta técnica se utiliza para visualizar células vivas no teñidas. Esto se debe a la forma en que se realiza la iluminación del espécimen, ya que, cuando se transmite un haz de luz de cono hueco al espécimen, los rayos de luz desviados (no reflejados/no refractados) no pasan a través de los objetivos, sino que la luz no desviada (reflejada/refractada) pasa a través de los objetivos al espécimen formando una imagen.

Esto hace que el campo circundante del espécimen parezca negro mientras que el espécimen aparecerá iluminado. Esto lo permite el fondo oscuro este el nombre, Microscopía de campo oscuro.

Aplicaciones del Microscopio de campo oscuro

• Se utiliza para visualizar los órganos internos de las células más grandes como las células eucariotas
• Identificación de células bacterianas con formas distintivas como el Treponema pallidum, un agente causante de la sífilis.

El Microscopio Fluorescente

Los microscopios antes mencionados normalmente producen imágenes después de que una luz haya sido transmitida y atravesada por el espécimen.

En el caso del Microscopio fluorescente, el espécimen emite luz. ¿Cómo? Añadiendo una molécula de colorante a la muestra. Esta molécula de colorante se excita normalmente cuando absorbe la energía de la luz, por lo que libera cualquier energía atrapada en forma de luz. La energía luminosa que libera la molécula excitada tiene una gran longitud de onda en comparación con la luz que irradia. La molécula de colorante es normalmente un fluorocromo, que se vuelve fluorescente cuando se expone a la luz de una determinada longitud de onda. La imagen que se forma es una imagen marcada con fluorocromo a partir de la luz emitida

El principio que subyace a este mecanismo de funcionamiento es que el microscopio fluorescente expondrá el espécimen a una luz ultra o violeta o azul, que forma una imagen del espécimen que emana la luz fluorescente. Tienen una lámpara de arco de vapor de mercurio que produce un intenso haz de luz que pasa a través de un filtro excitador. El filtro excitador funciona para transmitir una longitud de onda específica al espécimen teñido con fluorocromo, produciendo la imagen marcada con fluorocromo, en el objetivo.

Después del objetivo, hay un filtro de barrera que funciona principalmente para eliminar cualquier radiación ultravioleta que pueda ser perjudicial para la luz del observador, reduciendo así el contraste de la imagen.



Figura creada con biorender.com

Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

• Se utiliza en la visualización de agentes bacterianos como el Mycobacterium tuberculosis.
• Se utiliza para identificar anticuerpos específicos producidos contra antígenos/patógenos bacterianos en técnicas de inmunofluorescencia mediante el etiquetado de los anticuerpos con fluorocromos.
• Se utiliza en estudios ecológicos para identificar y observar microorganismos etiquetados por los fluorocromos
• También se puede utilizar para diferenciar entre bacterias muertas y vivas por el color que emiten al ser tratadas con tintes especiales

Además de los microscopios anteriormente comentados, existe uno no muy utilizado conocido como Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial. Es muy similar al microscopio de contraste de fase, en el que las imágenes se forman a partir de las variaciones de la luz desviada y no desviada. La diferencia es que aquí se emiten dos haces de luz hacia la muestra y se enfocan mediante un prisma. Uno de los haces atraviesa el prisma hasta la muestra, mientras que el otro atraviesa la zona transparente del portaobjetos sin la muestra. Los dos haces se combinan e interfieren entre sí para formar una imagen. Puede utilizarse para ver estructuras celulares como endosporas, paredes celulares bacterianas, núcleos y gránulos para especímenes no teñidos.
1. Microbiología por Laning M. Prescott, 5th Edition
2. https://science.umd.edu/CBMG/faculty/wolniak/wolniakmicro.html
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Bright-field_microscopy
5. https://sciencing.com/calculate-magnification-light-microscope-7558311.html
6. https://www.microscopemaster.com/brightfield-microscopy.html
7. https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-contrast_microscopy
8. https://www.microscopyu.com/techniques/phase-contrast/introduction-to-phase-contrast-microscopy
9. https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/phasecontrast/phase/
10. https://laboratoryinfo.com/types-of-microscopes/
Fuentes de Internet
• 1% – https://www.youtube.com/watch?v=zLxdiRpz77c
• 1% – https://www.slideshare.net/raiuniversity/b-sc-micro-i-btm-u-1-microscopy-and-staining
• 1% – https://quizlet.com/34169032/microbiology-chapter-2-microscopy-flash-cards/
• <https://www1.curriculum.edu.au/sciencepd/readings/ligh_refraction.htm
• <https://www.visioneng.com/resources/history-of-the-microscope/
• <https://www.uniassignment.com/essay-samples/biology/microscopy-and-characterization-of-cells-biology-essay.php
• <https://www.thoughtco.com/history-of-the-microscope-1992146
• <https://www.studyblue.com/notes/note/n/chapter-2-microscopy-exam-i/deck/9442340
• <https://www.soinc.org/sites/default/files/2017-01/8-17_MICROSCOPY_REVIEW.pdf
• <https://www.slideshare.net/indiandentalacademy/types-of-lensescosmetic-dentistry-courses
• <https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/light-microscopes
• <https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9781782420743000179
• <https://www.quora.com/What-is-the-major-difference-between-Phase-contrast-microscopy-and-Dark-field-microscopy
• <https://www.physicsclassroom.com/class/refln/Lesson-1/Specular-vs-Diffuse-Reflection
• <https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/resolutionintro/
• <https://www.leica-microsystems.com/science-lab/microscope-resolution-concepts-factors-and-calculation/
• <https://www.easybiologyclass.com/phase-contrast-microscopy-optical-components-working-principle-and-applications-short-notes-with-ppt/
• <https://www.coursehero.com/file/p5bthic/List-the-following-parts-of-the-microscope-and-describe-the-function-of-each-A/
• <https://www.azooptics.com/Article.aspx?ArticleID=691
• <https://www.answers.com/Q/What_is_coarse_adjustment_knob
• <https://therefractionoflight.weebly.com/scientific-explanation.html
• <https://sciencing.com/bright-light-microscopes-work-12122236.html
• <https://quizlet.com/93534849/bio-14-flash-cards/
• <https://quizlet.com/314905994/microbiology-flash-cards/
• <https://quizlet.com/25992559/microbiology-chapter-2-microscopy-flash-cards/
• <https://quizlet.com/243465240/bio-chapter-10-mastering-flash-cards/
• <https://quizlet.com/188090795/microscope-flash-cards/
• <https://quizlet.com/157085174/microscopy-flash-cards/
• <https://quizlet.com/152052977/chapter-2-section-1-lenses-and-the-bending-of-light-flash-cards/
• <https://quizlet.com/149716643/microscopy-and-specimen-preparation-flash-cards/
• <https://quizlet.com/12665120/microbiology-chpt-3-microscopy-staining-flash-cards/
• <https://quizlet.com/103278865/8-light-and-optics-flash-cards/
• <https://microscope-microscope.org/microscope-info/microscope-parts/
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Transmitted_light_microscope
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Phase_contrast_microscopy
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Optical_microscope
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Condenser_(optics)
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Condenser_(microscope)
• <https://en.wikipedia.org/wiki/Barlow_lens
• <https://courses.lumenlearning.com/boundless-physics/chapter/lenses/
• <https://answersdrive.com/what-is-a-microscope-and-how-does-it-work-6865065
• <http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/microscopy.html
• <http://www.brainkart.com/article/The-compound-light-microscope_20126/
• <http://web.utk.edu/~prack/MSE%20300/Lightmicroscopyhandout.pdf