Formación de biopelículas en dispositivos intrauterinos en pacientes con candidiasis vulvovaginal recurrente

Resumen

Una biopelícula es una comunidad compleja de células asociadas a la superficie encerrada en una matriz polimérica. Se adhieren a superficies sólidas y su formación puede verse afectada por las condiciones de crecimiento y la coinfección con otros patógenos. La presencia del biofilm puede proteger a los microorganismos de las defensas del huésped, así como reducir significativamente su susceptibilidad a los agentes antifúngicos. Los microbios patógenos pueden formar biofilms en las superficies inertes de dispositivos implantados, como catéteres, válvulas cardíacas protésicas y dispositivos intrauterinos (DIU). El presente estudio se llevó a cabo para analizar la presencia de biofilm en la superficie de dispositivos intrauterinos en pacientes con candidiasis vulvovaginal recurrente, y para determinar el perfil de susceptibilidad de las levaduras aisladas a la anfotericina B y al fluconazol. La Candida albicans se recuperó de los DIU y resultó ser susceptible a los agentes antifúngicos cuando se probó en condiciones de crecimiento planctónico. Estos hallazgos indican que la presencia del biofilm en la superficie del DIU es un importante factor de riesgo para la candidiasis vulvovaginal recurrente.

Introducción

El biofilm es una estructura compleja que puede ser producida por varios microorganismos, incluyendo miembros del género Candida. Su producción varía según el entorno y el sustrato disponible . Las biopelículas se adhieren a superficies sólidas y su formación puede verse afectada por las condiciones de crecimiento y la coinfección con otros microorganismos . La presencia de biofilms puede servir de reservorio de microorganismos y también puede provocar resistencia a los agentes antimicrobianos . Aunque las biopelículas bacterianas se han estudiado en detalle, hay pocos estudios sobre las biopelículas fúngicas relacionadas con la medicina. Los dispositivos intrauterinos (DIU) son el método más empleado para evitar la fecundación . En el presente trabajo se describen dos casos de pacientes con signos y síntomas de candidiasis vulvovaginal recurrente (CVR) que utilizaban DIU como método anticonceptivo. Tras su retirada, se analizó la presencia de biofilm en la superficie de los DIU y se investigó el patrón de susceptibilidad de las levaduras recuperadas de los dispositivos.

Materiales y métodos

Pacientes

Dos pacientes con signos y síntomas sugestivos de CVR, definidos por al menos cuatro episodios sintomáticos en 1 año , fueron incluidas en el presente estudio tras obtener la aprobación de la Junta de Revisión Institucional. Los estudios microbiológicos se realizaron en el Hospital de la Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil.

Caso 1

La paciente tenía 29 años, estaba casada, tenía dos hijos y presentaba síntomas clínicos sugestivos de CVR (presencia de flujo vaginal, prurito vulvar, picor y eritema). Se comprobó que era negativa a la infección por VIH y a la diabetes mellitus. La paciente había utilizado el DIU durante tres años y un mes como método anticonceptivo y refirió que los síntomas habían comenzado poco después de la implantación del dispositivo. Estos síntomas se habían intensificado durante el último año, principalmente en cuanto al prurito y la secreción. La paciente mencionó que en varias visitas ginecológicas anteriores había sido tratada con fluconazol. Durante su actual examen ginecológico, se recogió una muestra de la secreción de la vagina de la paciente con hisopos estériles de las paredes laterales de la vagina y del fondo del saco vaginal, con la ayuda de un espéculo no lubricado. El material clínico se recogió en fresco para su examen inmediato en 3 ml de solución salina estéril (NaCl 0,85%). Las secreciones vaginales se prepararon en la superficie de dos portaobjetos estériles para la tinción de Gram. Los hisopos vaginales se inocularon directamente en placas de Petri que contenían un medio de agar dextrosa Sabouraud (Difco, Detroit, EE.UU.), así como en placas de Petri que contenían CHROMagar Candida (París, Francia) para facilitar el aislamiento de Candida spp. Todos los cultivos se incubaron durante 10 días a 37°C. El DIU se extrajo de la paciente después de los exámenes ginecológicos y de laboratorio. La extracción del DIU se llevó a cabo en condiciones antisépticas y se realizó sin que el DIU tocara la pared vaginal o el instrumento de apertura para evitar la contaminación por la flora vaginal. Inmediatamente después de la extracción del DIU, la paciente fue tratada por vía oral con una dosis única de 150 mg de fluconazol. Tres meses después de la extracción del DIU, la paciente volvió para un segundo examen ginecológico en el que no presentó signos o síntomas sugestivos de CVR y los exámenes de laboratorio de las secreciones vaginales fueron negativos para levaduras.

Caso 2

La paciente tenía 38 años, estaba casada y presentaba síntomas clínicos sugestivos de CVR (presencia de flujo vaginal con aspecto grumoso, prurito vulvar y picor). Ella también resultó ser negativa para el VIH y la diabetes mellitus. La paciente informó de que el flujo y el picor habían empeorado en los últimos dos años. Llevaba unos cinco años utilizando un DIU como método anticonceptivo. La paciente mencionó que en anteriores visitas ginecológicas había sido tratada con fluconazol. Durante el examen ginecológico, se recogieron secreciones vaginales con hisopos estériles con la ayuda de un espéculo no lubricado. El material clínico se recogió en fresco para su examen inmediato en 3 ml de solución salina estéril (NaCl 0,85%). Las secreciones vaginales se prepararon en la superficie de dos portaobjetos estériles para la tinción de Gram. Los hisopos vaginales se inocularon directamente en placas de Petri que contenían medio de agar dextrosa Sabouraud (Difco, Detroit, EE.UU.), así como en placas de Petri que contenían CHROMagar Candida (París, Francia) para facilitar el aislamiento de Candida spp. Todos los cultivos se incubaron durante 10 días a 37°C. Después de los exámenes clínicos y de laboratorio, se extrajo el DIU en condiciones antisépticas y se examinó mediante microscopía electrónica de barrido. La extracción se realizó sin tocar el DIU con la pared vaginal ni con el instrumento de apertura para evitar la contaminación por la flora vaginal. Inmediatamente después de la extracción del DIU, la paciente fue tratada por vía oral con una dosis única de 150 mg de fluconazol. Tres meses después de la extracción del DIU, la paciente volvió para un segundo examen ginecológico, en el que no presentó signos o síntomas sugestivos de CVR y los exámenes de laboratorio de la secreción vaginal fueron negativos para levaduras.

Aislamiento e identificación de las levaduras

Las levaduras aisladas de las muestras de secreción de las pacientes fueron identificadas en base a la producción de tubos de germen en suero de ternera fetal a 37°C durante 2 h, la producción de camidosporas en agar harina de maíz (Oxoid) con Tween 80 (Sigma) según el método de Dalmau, la asimilación de fuentes de carbono, tal como recomiendan Kurtzman y Fell, 1998, y la utilización del kit comercial de prueba API 20C AUX (bioMérieux). Con fines comparativos, los aislados de Candida dubliniensis se sometieron a una prueba por muestreo en la superficie de una placa de agar SDA (Difco, Detroit, MI, EE.UU.) y se incubaron a 42°C como se ha descrito anteriormente. Todos los aislados que se recuperaron eran sugestivos de Candida albicans y para confirmar esta identificación, se realizaron estudios de PCR como se ha descrito previamente con el cebador oligonucleótido específico de la especie hacia delante CAL5 (5′ TGT TGC TCT CTG GGG GGC CG 3′) y el cebador inverso NL4CAL (5′ AAG ATC ATT ATG CCA ACA TCC TAG GTA AA 3′) para confirmar Candida albicans. Se utilizó como control la cepa 90028 de Candida albicans de la American Type Culture Collection (ATCC). El método de PCR utilizado se realizó de acuerdo con lo descrito por Mannarelli y Kurtzman.

Microscopía electrónica de barrido

Las UDIs se lavaron con agua estéril para eliminar las células de levadura no adheridas. Las biopelículas formadas en las UDIs se fijaron con glutaraldehído al 2,5% (v/v) en PBS 0,15 M durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se trataron con tetróxido de osmio al 1% (p/v) durante 1 hora, se lavaron tres veces con agua destilada, se trataron con acetato de uranilo al 1% (p/v) durante 1 hora y se lavaron de nuevo con agua destilada. A continuación, las muestras se deshidrataron en etanol. Todas las muestras se secaron hasta el punto crítico, se sometieron a una metalización con capa de oro y se realizaron observaciones con el microscopio electrónico de barrido JEOL-JSM 6100 (Jeol Ltda, Tokio, Japón) en el Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo, Brasil.

Pruebas de susceptibilidad

Los agentes antifúngicos utilizados en este estudio fueron anfotericina B (Sigma, St. Louis MO, USA) y fluconazol (Pfizer Central Research, New York, USA). Las pruebas de susceptibilidad se realizaron como se describe en el documento M27-A3 . Las soluciones madre se prepararon en agua (para el fluconazol) y en dimetilsulfóxido (para la anfotericina B). Se prepararon otras diluciones de cada agente antifúngico con medio RPMI 1640 al 0,2% de glucosa (Sigma) que había sido tamponado a pH 7,0 con ácido morfolino-propanosulfónico 0,165 M (Sigma), con L-glutamina y rojo fenol como se indica en el documento M27-A3 (2008). Las diluciones del fármaco (que contenían el doble de la concentración final) se dispensaron en placas de microdilución de 96 pocillos que se sellaron y se almacenaron congeladas a -70 °C hasta el día del ensayo. Posteriormente, las levaduras se subcultivaron en agar dextrosa Sabouraud (Difco), durante 24 horas a 35°C, antes de las pruebas de susceptibilidad antifúngica. El inóculo se preparó para el análisis espectrofotométrico, realizado a 530 nm, y la concentración final del inóculo de levaduras fue de 0,5×103 a 2,5×103 UFC/ml. Las placas se incubaron a 35°C durante 48 h en una incubadora sin CO2. Los criterios de interpretación de la concentración mínima inhibitoria (CIM) en la prueba de susceptibilidad fueron los publicados en el documento M27-A3 (2008).

Resultados

El primer examen de laboratorio de la secreción vaginal de la paciente 1 no reveló la presencia de células de levadura, micelios o tricomonas móviles en el montaje húmedo. El examen microscópico de los frotis vaginales teñidos de Gram indicó la presencia de levaduras con blastoconidias y pseudomicelios (Fig. 8A). Candida albicans se identificó mediante técnicas fenotípicas y se confirmó mediante métodos de PCR. El primer examen de laboratorio de la secreción vaginal de la paciente 2 no reveló la presencia de células de levadura y tricomonas móviles. El examen de los frotis con tinción de Gram demostró la presencia de levaduras con blastoconidias (Fig. 8B), que posteriormente fueron identificadas como Candida albicans, confirmadas por el método de PCR. Tras la retirada de los DIU, no se encontraron levaduras en los segundos exámenes de laboratorio de las secreciones vaginales de ambas pacientes. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad in vitro en condiciones planctónicas de las dos cepas de Candida albicans recuperadas como parte de los primeros exámenes de laboratorio revelaron que eran susceptibles a los agentes antifúngicos probados. Las CMI de la cepa aislada del paciente 1 fueron de 0,25 µg/ml para la anfotericina B y de 0,5 µg/ml para el fluconazol. Las CMI de la cepa aislada de la paciente 2 fueron de 0,5 µg/ml para la anfotericina B y de 2,0 µg/ml para el fluconazol. La Fig. 1 muestra el dispositivo intrauterino de la paciente 1 antes de la microscopía electrónica de barrido. El examen reveló una biopelícula heterogénea adherida (Figs. 2A, 2B, 3 y 4) en la superficie de la bobina de cobre del DIU. El análisis del biofilm reveló la presencia de una gran variedad morfológica de bacterias que estaban incrustadas en una matriz fibrosa (Fig. 3), con varios tipos de células – leucocitos polimorfonucleares y fibrina. También se observaron levaduras adheridas en la superficie del biofilm (Fig. 4). Las Figs. 5-7 muestran los resultados del microscopio electrónico de barrido con el DIU de la paciente 2. De nuevo, se observó una gran variedad de tipos morfológicos de células y microorganismos, incrustados en una matriz fibrosa presente en la superficie de la bobina superior. La Fig. 6 muestra un gran agregado de células y microorganismos mezclados en el DIU, mientras que la Fig. 7 también muestra la levadura presente en la superficie de la bobina superior de la paciente 2.