Biol Res 44:195-199, 2011
Cultivo extendido hasta el estadio de blastocisto: una estrategia para evitar embarazos múltiples en tecnologías de reproducción asistida
Soledad J Sepúlveda, Jimmy R Portella, Luis P Noriega, Ernesto L Escudero & Luis H Noriega
Grupo de Reproducción Asistida de PRANOR.
ABSTRACT
El objetivo de este estudio fue revisar la experiencia y los resultados de los ciclos de reproducción asistida con embriones cultivados hasta el día 5 de desarrollo, comparando diferentes parámetros según las edades de los pacientes.
Estudiamos retrospectivamente 1.874 ciclos de reproducción asistida en los que el cultivo de embriones se prolongó hasta el quinto o sexto día de desarrollo. Se incluyeron todos los ciclos de FIV e ICSI, comparando, según la edad de las pacientes, las siguientes tasas: formación de blastocistos, embarazo, implantación y aborto. Como control, se analizaron los ciclos con ovocitos donados de donantes jóvenes (OD). El número de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto es similar en todos los grupos de pacientes. Sólo el grupo de DO fue diferente en cuanto a la formación de blastocistos y las tasas de embarazo e implantación. Las pacientes mayores de 39 años tuvieron una tasa de aborto del 59,1 %, que es significativamente mayor que la de los otros grupos.
El cultivo de embriones ampliado hasta el estadio de blastocisto puede implementarse en los programas de reproducción asistida para aumentar la tasa de embarazo. El potencial de implantación del blastocisto es alto, lo que nos permite transferir menos embriones y reducir la probabilidad de embarazos múltiples.
Palabras clave: blastocisto, cultivo prolongado, tasa de embarazo, tasa de implantación.
INTRODUCCIÓN
El reto de las técnicas de reproducción asistida (TRA) es evitar los embarazos múltiples, que podrían ser causados por el alto número de embriones transferidos. Por ello, se espera que el objetivo sea transferir un solo embrión, pero bien seleccionado. En general, los laboratorios de reproducción asistida seleccionan los embriones a transferir basándose en la morfología, ya que es la única herramienta sencilla. Sin embargo, una buena morfología no siempre está relacionada con el resultado del embrión y puede implicar aneuploidías múltiples.
En la última década se han desarrollado sistemas de cultivo que permiten un desarrollo extendido hasta el estadio de blastocisto y posteriormente la selección de los mejores embriones para ser transferidos (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). Sin embargo, el desarrollo humano temprano es ineficiente y sólo unos pocos cigotos alcanzarán la fase de blastocisto y la implantación. Por lo tanto, un embrión que se desarrolla hasta la fase de blastocisto se somete a una selección espontánea durante el cultivo in vitro.
Formación de blastómeros
Después de pasar por la trompa, el embrión es una mórula. En los blastómeros periféricos se establecen uniones estrechas que sellan el espacio entre las células externas que forman los trofoblastos. El sellado impide la difusión de material intercelular en el espacio extraembrionario y así se forma la cavidad blastocelular. La mórula, compuesta por un tipo unicelular, se transforma en un blastocisto, donde se reconocen dos tipos de células. Los blastómeros periféricos forman un epitelio aplanado llamado trofoblasto, y los blastómeros centrales forman la masa celular interna. Estas células dan lugar al propio embrión y a parte de los anexos embrionarios. El trofoblasto da lugar a la mayoría de los anexos. El blastocisto humano expandido contiene más de 90 células, de las cuales se estima que un 10% forman la masa celular interna (figura 1).
La cavidad de la blastocélula está formada por la confluencia de vacuolas. Crece por la acción de la Na+ / K+ ATPasa localizada en la membrana de las células del trofoblasto. Los iones Na+ entran en la cavidad, que comienza a incorporar agua para mantener el equilibrio osmótico. El movimiento del agua durante la cavitación también puede ser facilitado por las acuaporinas en las membranas apical y basolateral en el trofectodermo (Barcroft et al., 2003). Así, la cavidad se expande y comienza la eclosión, tras lo cual el embrión se adhiere a la superficie del endometrio, invadiendo y haciendo contacto con el sistema vascular de la madre durante la implantación. Este procedimiento puede durar un par de días y pasa por las etapas ilustradas en la figura 1. En primer lugar, se forma un blastocisto temprano, con una pequeña cavidad, que crece hasta formar un blastocisto completo. A partir de esta etapa, se empieza a clasificar el número de células del trofoblasto y la masa celular interna. Comienza la expansión y finalmente la eclosión a través de la zona pelúcida (Figura 1). Esta clasificación permite seleccionar para la transferencia los blastocistos con mayor potencial de crecimiento. La lógica de prolongar el cultivo embrionario hasta el quinto día no es mejorar su calidad, sino aumentar la probabilidad de elegir el embrión con mejor potencial de implantación.
ADVANTAJAS DEL CULTIVO EXTENDIDO AL BLASTOCITO
Es importante disponer de un método de cribado embrionario que permita transferir el mínimo número de embriones sin afectar a la posibilidad de embarazo. El desarrollo de medios por los que los embriones crecen durante más tiempo, hasta el estadio de blastocisto permite seleccionar los mejores embriones para ser transferidos. Así, ha aumentado las tasas de implantación y ha reducido las gestaciones múltiples. Un meta-análisis, que evaluó 18 estudios controlados aleatorios, informó de que existe una diferencia significativa en las tasas de embarazo y partos con vida para las transferencias en el día 5 en comparación con las transferencias en el día 3 (Blake et al., 2007).
La idea de que los medios secuenciales son necesarios para el desarrollo óptimo de los embriones tiene un atractivo intuitivo, pero no está respaldada por pruebas experimentales directas (Biggers et al., 2005). En estos sistemas de cultivo de medios secuenciales, el medio utilizado para el cultivo de embriones del día 1 al 3 de desarrollo difiere en composición y/o concentración de componentes del medio utilizado para el cultivo posterior desde el día 3 hasta el estadio de blastocisto (Gardner & Lane, 1997, 1998). Hemos demostrado que el desarrollo in vitro hasta el estadio de blastocisto y las tasas de implantación posteriores son mejores para los embriones humanos cultivados en un único medio que para los cultivados en un sistema de medios secuenciales (Sepúlveda et al., 2009). La fecundación no se produce al mismo tiempo en todos los óvulos, por lo que el momento de cada embrión es diferente. Por lo tanto, sería mejor un único medio, donde el embrión utiliza lo que necesita.
Hay varias ventajas para el cultivo hasta el estadio de blastocisto. Como se ha comentado anteriormente, el cultivo a más largo plazo permite distinguir entre los embriones viables con mayor potencial de implantación de los que se desarrollaron inicialmente pero mueren después. También permite evaluar la activación genómica del embrión (Braude et al., 1988), buscando los embriones que no llegan al estadio de 8 células. Las pruebas demuestran que hay una menor tasa de abortos tempranos cuando se transfieren blastocistos (Papanikolaou et al., 2006).
In vivo, los embriones en fase de clivaje suelen estar en las trompas de Falopio, no en el útero, por lo que la sincronización de la transferencia de embriones en fase de blastocisto con el entorno uterino es más fisiológica (Gardner et al., 1996). Otra ventaja del cultivo a largo plazo es el tiempo prolongado, que permite la transferencia cuando se extraen los blastómeros en el día 3 para el diagnóstico genético preimplantacional.
El objetivo de este estudio fue revisar la experiencia y los resultados de los ciclos de reproducción asistida con embriones en el día 5 de desarrollo, comparando diversos parámetros según la edad de la paciente.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudiamos retrospectivamente 1.874 ciclos de reproducción asistida en los que se cultivaron embriones hasta el quinto o sexto día de desarrollo, incluyendo procedimientos de donación de ovocitos (DO, n = 1.192; 2004 – 2010), fecundación in vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (n = 682, 2008-2010).
Se compararon las siguientes tasas según la edad de la paciente: formación de blastocistos, embarazo, implantación y aborto.
Inseminación / inyección
Para la inseminación en la FIV convencional, se co-cultivaron unos 100.000 espermatozoides con complejos cúmulo-corona-ovocitos. Para la ICSI, sólo se inyectaron los ovocitos en metafase II (MII), utilizando los procedimientos descritos anteriormente (Sepúlveda et al., 2009).
Cultivo de embriones
Los ovocitos fecundados (2PN) se cultivaron individualmente en gotas de medio 10 |UL Global® (Global Life, Canadá) suplementado con un 10 % de sustituto sintético del suero (SSS). El día 3, los embriones se cambiaron al medio Global® fresco. Los cultivos se realizaron bajo aceite mineral a 37 ° C en una atmósfera de 6,5 % de CO2, 5 % de O2 y 88,5 % de N2. Las evaluaciones del desarrollo embrionario se realizaron bajo los procedimientos descritos (Sepúlveda et al., 2009).
Transferencia de embriones
Las transferencias de embriones se realizaron en el día 5 o 6 de cultivo de embriones, utilizando un catéter Frydman Ultrasoft (CCD Laboratories, Francia). Se seleccionaron uno o dos embriones para la transferencia. Si había más embriones disponibles, se congelaban o vitrificaban.
Definición de los parámetros analizados
La tasa de formación de blastocistos es el número total de blastocistos entre el total de ovocitos 2PN. La tasa de embarazo se definió como el número de ciclos con al menos un saco gestacional entre el número de ciclos transferidos. La tasa de aborto se definió como el número de embarazos con pérdida total de sacos gestacionales antes de las 20 semanas de gestación entre el número de embarazos. La tasa de implantación se calculó a partir del número de sacos gestacionales entre el número total de embriones transferidos.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico STATA 10.0 (StataCorp LP, 4905 Lakeway Drive, College Station, TX, USA). La normalidad de la distribución de las variables continuas se evaluó con una prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las variables continuas se evaluaron con estadísticas paramétricas (prueba t de Student) o no paramétricas (prueba de suma de rangos de Mann-Whitney). Para las variables no continuas, se utilizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Las diferencias se consideraron significativas con un valor p de <0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el programa de donación de ovocitos, los cultivos de blastocitos se iniciaron en 2004 con un 4 % de ciclos. Actualmente, el cultivo ampliado hasta el estadio de blastocisto se ha convertido en una técnica rutinaria, produciéndose en el 90 % de los casos en 2010 (Figura 2).
La tabla 1 describe los 4 grupos que se compararon. Pacientes menores de 35 años, pacientes entre 34 y 39 años, pacientes mayores de 39 años y pacientes que recibieron ovocitos de donantes jóvenes (DO). El número de ovocitos obtenidos en la aspiración folicular, como era de esperar, disminuyó con la edad. La proporción de ciclos en los que se utilizó la ICSI como método de inseminación fue similar en todos los grupos (Tabla 1).
El número de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto fue similar en los tres grupos de pacientes con tendencia a disminuir según la edad. Sin embargo, cuando el ovocito pertenecía a una donante (DO), la tasa de formación de blastocistos aumentó en más de un 40 % (p< 0,05). La tasa fue del 40 % entre las pacientes más jóvenes y del 34 % entre las de mayor edad (Tabla 2). En contraste con nuestros resultados, Thomas et al. (2010) informaron de que la edad de las pacientes se asociaba negativamente con la formación de blastocistos. Del mismo modo, el porcentaje de embriones criopreservados es mayor entre el grupo de OD y las pacientes menores de 35 años que entre las pacientes mayores de 35 años (Tabla 2).
El porcentaje de ciclos con transferencias canceladas fue de aproximadamente el 15 % entre las pacientes mayores de 34 años (Figura 3). Las cancelaciones podrían deberse al bajo número de ovocitos obtenidos durante la recogida de óvulos, lo que hace que haya menos o ningún embrión disponible, en comparación con la recogida con mujeres más jóvenes. Sin embargo, algunos informes han demostrado que la transferencia de blastocitos puede ser aplicable a cualquier paciente sin comprometer la probabilidad de transferencia de embriones o de embarazo (Marek et al., 1999; Wilson et al, 2002).
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La tasa de embarazo varió según la edad de la paciente: 48.4% para las mujeres menores de 35 años y 38,6% para las mayores de 39 años (Figura 4). Cuando los ciclos se realizaron con ovocitos donados de mujer joven, la tasa de embarazo se elevó al 58,1 %, un valor mayor que en todos los grupos de pacientes (p <0,005).
En este estudio, el número máximo de embriones transferidos fue de dos, lo que ha sido nuestra política desde 2004 para evitar el riesgo de embarazos múltiples. La alta tasa de implantación mostrada en todos los grupos refleja el mayor potencial de implantación de los embriones transferidos en el quinto día (Figura 4), también mostrado por otros estudios (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). Sin embargo, la tasa de implantación es menor en las pacientes en comparación con el grupo OD. Esto puede explicarse por factores adicionales relacionados con la causa de la infertilidad en las pacientes (Marino et al., 2011), ya que las donantes de óvulos son mujeres jóvenes sin problemas reproductivos aparentes. Además, existen evidencias de cambios severos en el desarrollo endometrial en los ciclos estimulados (Haouzi et al., 2010). Esto puede ser beneficioso para las receptoras del grupo de DO porque no fueron estimuladas.
Aunque la tasa de embarazo de las pacientes de mayor edad es alta con la transferencia de blastocistos, la tasa de aborto es del 59,1 %, que es significativamente más alta que las tasas de los otros grupos (Figura 5).
Este estudio, al igual que otros, ha demostrado una disminución de la fertilidad para las mujeres mayores de 35 años (Van Noord-Zaadstra et al, 1991; Perheentupa & Huhtaniemi, 2099), que es significativamente menor que el descenso entre las mujeres mayores de 40 años (Marcus & Brinsden, 1996). Por otra parte, la menor probabilidad de lograr un embarazo exitoso relacionada con el aumento de la edad materna se caracteriza por una mayor prevalencia de anomalías cromosómicas en el ovocito que conducen, en última instancia, a una reducción significativa de las tasas de implantación (Munné, 2002) y a altas tasas de aborto espontáneo (Munné et al., 1995; Nybo-Andersen et al, 2000).
El cultivo de embriones extendido hasta el estadio de blastocisto puede implementarse en un programa de reproducción asistida para aumentar la probabilidad de embarazo en las pacientes, ya que la selección natural puede ocurrir durante el cultivo de embriones.
El potencial de implantación del blastocisto es alto, lo que nos permite transferir menos embriones y reducir la probabilidad de embarazos múltiples. El cultivo de blastocistos es una alternativa que permite elegir un solo embrión para transferir en mujeres jóvenes.
La tasa de cancelación es mayor entre las pacientes mayores de 35 años, quizás debido a la disminución de la reserva ovárica y al menor número de ovocitos obtenidos, dado que los embriones alcanzan el estadio de blastocisto independientemente de la edad de la paciente.
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