Cómo diseñar un cebador

Diseño de cebadores para PCR

Los cebadores de oligonucleótidos son necesarios cuando se realiza una reacción de PCR. Hay que diseñar cebadores que sean complementarios a la región molde del ADN. Se sintetizan químicamente mediante la unión de nucleótidos. Hay que bloquear y desbloquear repetidamente los grupos reactivos de un nucleótido al añadir un nucleótido de uno en uno. La principal propiedad de los cebadores es que deben corresponder a secuencias de la molécula molde (deben ser complementarios a la cadena molde). Sin embargo, no es necesario que los cebadores se correspondan completamente con la cadena molde; no obstante, es esencial que el extremo 3′ del cebador se corresponda completamente con la cadena de ADN molde para que pueda producirse la elongación. Normalmente se utiliza una guanina o una citosina en el extremo 3′, y el extremo 5′ del cebador suele tener tramos de varios nucleótidos. Además, ambos extremos 3′ de los cebadores hibridados deben apuntar el uno hacia el otro.

El tamaño del cebador también es muy importante. Los cebadores cortos se utilizan principalmente para amplificar un fragmento pequeño y sencillo de ADN. Por otro lado, un cebador largo se utiliza para amplificar una muestra de ADN genómico eucariota. Sin embargo, un cebador no debe ser demasiado largo (> cebadores de 30 polímeros) ni demasiado corto. Los cebadores cortos producen un producto de amplificación de ADN inexacto e inespecífico, y los cebadores largos dan lugar a una tasa de hibridación más lenta. Por término medio, el fragmento de ADN que debe amplificarse debe tener un tamaño de entre 1 y 10 kB.

La estructura del cebador debe ser relativamente simple y no contener ninguna estructura secundaria interna para evitar el plegamiento interno. También hay que evitar el recocido del cebador, que crea dímeros de cebador e interrumpe el proceso de amplificación. Cuando se diseña, si no se está seguro de qué nucleótido poner en una determinada posición dentro del cebador, se puede incluir más de un nucleótido en esa posición, lo que se denomina sitio mixto. También se puede utilizar un inserto molecular basado en un nucleótido (inosina) en lugar de un nucleótido normal para obtener una mayor capacidad de emparejamiento.

Tomando en consideración la información anterior, los cebadores deberían tener generalmente las siguientes propiedades:

• Longitud de 18-24 bases
• Contenido de 40-60% de G/C
• Empieza y termina con 1-2 pares de G/C
• Temperatura de fusión (Tm) de 50-60°C
• Los pares de primers deben tener una Tm dentro de los 5°C de cada uno
• Los pares de primers no deben tener regiones complementarias

  Nota: Si va a incluir un sitio de restricción en el extremo 5′ de su cebador, tenga en cuenta que debe añadirse una «abrazadera» de 3 a 6 pares de bases aguas arriba para que la enzima pueda escindir eficientemente (e.Por ejemplo, GCGGCG-sitio de restricción-su secuencia).