Vareta de origami de ADN para filamentos espessos artificiais
Vareta de origami de ADN foram concebidas usando o software caDNAno43 (Suplementar Fig. 1). Para dobrar a haste de origami de ADN, 50 nM de andaime (p8064, nanosistemas tilibit) foi misturado com agrafos de 500 nM de núcleo. Os oligonucleótidos foram obtidos da Hokkaido System Science ou IDT. A reacção de dobragem foi realizada em tampão dobrável (5 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA e 18 mM MgCl2) com aquecimento rápido até 80 °C e arrefecimento em passos de grau único até 60 °C durante 2 h, seguido de arrefecimento adicional em passos de grau único até 25 °C durante mais 72 h. Uma lista completa de todas as sequências de oligonucleótidos pode ser encontrada em Dados Suplementares 2.
As hastes de origami de ADN dobrado foram purificadas por ultracentrifugação com gradiente de glicerol de acordo com Lin et al.44. Resumidamente, foram feitas soluções de glicerol com gradiente de 15-45% (v/v) em tampão 1 × TE contendo 18 mM MgCl2, e as fracções de glicerol contendo varetas de origami de ADN monomérico foram determinadas por electroforese em gel de agarose. A concentração das hastes de origami de ADN foi determinada por um espectrofotómetro de Nanodrop (Thermo Scientific), e a solução foi aliquotada e armazenada a -80 °C até à utilização.
Concepção da construção
Para o subfragmento-1 (S1) da construção da miosina, a miosina IIa cDNA do músculo esquelético humano (Kazusa Product ID FXC25901) foi truncada em Ala849. Este fragmento incluía o domínio motor, o domínio de ligação das cadeias ligeiras essenciais (ELC) e o domínio de ligação das cadeias ligeiras regulamentares (RLC). Para a etiquetagem de oligonucleótidos e purificação de proteínas, a SNAP-tag (New England Biolabs Inc.), a FLAG-tag e a 6 × His-tag foram anexadas no terminal C. Dois aminoácidos (Leu-Glu) correspondentes ao local de reconhecimento de endonucleotídeos de restrição (XhoI: CTCGAG) foram mantidos entre SNAP-tag e FLAG-tag. Para a cadeia ligeira construção nula (S1 sem alavanca), os locais de ligação ELC e RLC (Lys786-Leu846) foram eliminados da construção S1. Estes fragmentos de miosina foram introduzidos a jusante do sítio de clonagem múltipla do vector pShuttle-CMV (Agilent Technologies). Para o domínio de ligação de actina da construção α-actinina, humano α-actinina 1 cDNA (Addgene; pEGFP-N1 alpha-actin1) foi truncado no domínio de ligação de actina (Asp1-Ala247). Para a rotulagem de oligonucleotídeos e purificação de proteínas, a SNAP-tag e a 6 × His-tag foram fixadas no terminal C através de ligadores (3 a.a., GGL). Este α-actinin1-SNAP-His fragmento foi introduzido a jusante do promotor T7 do plasmídeo pET T7-7 (Addgene).
Expressão e purificação de proteínas
Miosina humana IIa S1 e S1 sem braço de alavanca: Os adenovírus recombinantes foram produzidos utilizando o sistema AdEasy XL Adenoviral Vector System (Agilent Technologies). Os adenovírus produzidos foram purificados utilizando o Kit de Purificação de Vírus AdEasy (Tecnologias Agilent). A expressão e purificação da miosina recombinante foram realizadas de acordo com um estudo prévio31. Resumidamente, os miooblastos murinos C2C12 (RIKEN Cell Bank) foram cultivados em DMEM (alta glucose, Nacalai tesque) suplementados com 10% FBS (Gibco) e 1% Penicilina/Streptomicina (Nacalai tesque). Para induzir a diferenciação em miotrubos, as células foram cultivadas até à confluência, e o meio foi substituído por DMEM suplementado com 2% de soro de cavalo (Gibco) e 1% de Penicilina/Streptomicina. Quarenta e oito horas após a diferenciação, as células foram infectadas com 1 × 106-8 unidades formadoras de placas de vírus. Quarenta e oito horas pós-infecção, o meio foi novamente mudado para meio de crescimento. Após 3-5 dias de troca do meio, as células foram lavadas com PBS e recolhidas através de raspagem celular. As células foram então lisadas com um homogeneizador de ressalto e centrifugadas. A miosina recombinante foi purificada do lisado clarificado utilizando o sistema de purificação AKTA como se segue (GE Healthcare). Primeiro, a miosina foi purificada pela purificação por afinidade His-tag com uma coluna de níquel-sefarose HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare). A solução de miosina eluida foi então dialisada de um dia para o outro a 4 °C num tampão de baixo sal (25 mM imidazol pH 7,0, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT). Finalmente, a miosina recombinante foi purificada numa coluna de troca de aniões HiTrap Q HP de 1 ml (GE) utilizando um gradiente linear de NaCl 0-1 M.
Para preparar o domínio de ligação de actina de α-actinina, primeiro, o plasmídeo pET T7-7 contendo a sequência α-actinina foi transformado na estirpe E.coli Rosetta (DE3). O meio LB com 100 μg mL-1 ampicilina foi inoculado com células de Roseta pré-culturizadas e depois incubado a 37 °C. A sobreexpressão de α-actinina foi induzida pela adição de isopropil β-D-iogalactopiranósido (IPTG) a uma concentração final de 0,5 mM quando OD600 atingiu 0,6-0,8. As células foram cultivadas de um dia para o outro a 16 °C. As células foram colhidas por centrifugação (50.000 × g a 4 °C durante 30 min), ressuspendidas em tampão fosfato de sódio 25 mM pH 7,6, 150 mM NaCl, 10 mM β-Me, e inibidor de proteínas (PI) (Thermo:Halt™ Coquetel Inibidor de Protease, livre de EDTA (100 × )) e armazenado a -20 °C. As células congeladas foram descongeladas e depois lisadas por sonicação. Triton X-100 e polietilenoimina foram adicionados a concentrações finais de 1% e 0,05%, respectivamente. Após 30 min sobre gelo, os detritos celulares foram removidos por centrifugação a 50.000 × g, 4 °C durante 30 min Imidazole foi adicionado ao sobrenadante clarificado para dar uma concentração final de 10 mM. As Resinas de Afinidade Metálica TALON (Clontech) equilibradas com tampão normal (25 mM de tampão fosfato de sódio (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 10 mM β-Me) foram adicionadas à solução proteica extraída α-actinina e incubadas durante 30 min a 4 °C para as ligar às placas de histidina. As proteínas não ligadas especificamente foram removidas com tampão de lavagem (tampão normal contendo 10 mM de imidazol e PI). As proteínas α-actinina foram eluídas com tampão de eluição (tampão normal contendo 100 mM imidazol e PI).
Etiquetagem de oligonucleótidos
Reacções de etiquetagem de oligonucleótidos para a miosina II foram realizadas logo após a purificação por troca de aniões. Os oligonucleótidos de DNA modificado com aminas (NH2/GTGATGTAGGTGGTAGAGGAA) (Hokkaido System Science) foram ligados ao substrato SNAP, benzilguanina (BG; NEB), e 15-25 μM de BG-oligonucleótidos foram etiquetados com ~1 μM myosin II contendo uma etiqueta SNAP-tag C-terminal (NEB) em tampão de eluição de troca de aniões durante 30 min à temperatura ambiente. A miosina II marcada com oligonucleótido foi purificada por afinidade de filamentos de actina, aliquotada e armazenada a -80 °C até à sua utilização. A eficiência da rotulagem dos oligonucleótidos a myosin II foi estimada através de um ensaio de gel-shift (4-15% gradiente de gel, Biorad) e determinada como >99% tanto para S1 como para S1 sem braço de alavanca (Suplementar Fig. 2).
Reacções de rotulagem de oligonucleótidos para α-actinina foram realizadas imediatamente após a purificação da sua afinidade com a marca His-tag. O substrato SNAP, os oligonucleótidos de ADN modificados com BG (TGGATATGGTGGGAGGAGAGAG/BG) foram preparados como descrito na preparação de miosina acima, e 15-25 μM de BG-oligonucleótidos foram rotulados com ~1 μM α-actinina contendo um C-terminal SNAP-tag no tampão de eluição de afinidade His-tag durante 30 min à temperatura ambiente. A oligonucleotídeos marcados com α-actinina foi purificada por uma coluna de troca de aniões (HiTrapQ HP), aliquotada e armazenada a -80 °C até à sua utilização. A eficiência da rotulagem dos oligonucleótidos a α-actinina foi estimada por um ensaio de gel-shift (4-15% gradiente de gel, Biorad) e determinada como >95%.
Conjugação DNA-GNP
Forty nanometer GNPs (British BioCell International) foram ressuspendidos e incubados de um dia para o outro em 2,5 mM Bis (p-sulfonatofenil)fenilfosfina dipotássica (BSPP) solução (Sigma-Aldrich) enquanto agitava suavemente para estabilizar os GNPs a altas concentrações de partículas45. Para realizar uma conjugação rápida, seguimos um protocolo de conjugação assistida por pH46,47 como se segue. 0,15 nM GNPs foram concentrados 15 vezes por centrifugação a 5000 × g durante 10 min 400 μM thiolated oligonucleotide (correspondente ao ‘thiol/TTTTTTTTTTTTTTTTT’) foi tratado com 100 mM de Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP, Sigma-Aldrich) e purificado utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad). A purificação da coluna foi realizada três vezes. Foram adicionados 4,800 vezes oligonucleótidos em excesso aos PNBs concentrados. O tampão citrato-HCl (pH = 3) foi adicionado a uma concentração final de 10 mM. Após 10 min de incubação, foi adicionado 1 M de tampão Hepes (pH = 7) a uma concentração final de 100 mM. Os GNPs conjugados com ADN foram armazenados a 4 °C.
Conjugação de origami de DNA-myosin-GNP
Antes da observação, os GNPs conjugados com ADN foram separados de uma quantidade excessiva de oligonucleótido por filtros de 100 kDa MWCO (Amicon Ultra, MERCK) com tampão TE adicionado ao filtro. A filtração foi realizada quatro vezes. Os GNPs conjugados com ADN foram finalmente ressuspensos em tampão TE com 11 mM MgCl2 de modo a que a concentração final de GNP se tornasse ~1 nM. DNA-GNPs purificados, hastes de origami de DNA, domínios de ligação de actina de α-actinina e miosinas foram misturados a uma razão molar de ~1:1:80:50 e incubados pelo menos durante 1 h.
Preparação de amostras para imagens de GNP
experiências de imagens de GNP foram realizadas dentro de uma câmara de fluxo montada com um vidro revestido de diclorodimetilsilano (DDS)-48 como se segue. As lamelas foram limpas por plasma de baixa pressão durante 3 min com um sistema de plasma (Zepto, Diener electronic, Alemanha). Após lavagem com acetona, as lamelas foram mergulhadas em acetona durante 20 min com sonicação e depois em etanol durante mais 20 min com sonicação. Após enxaguamento com Milli-Q, as lamelas foram filtradas em 1 M KOH durante 1 h. Após sonicar novamente em acetona e etanol, as lamelas foram filtradas em 5 M KOH durante 1 h. As lamelas foram enxaguadas com Milli-Q e secas por um ventilador de ar. Depois de enxaguadas com hexano, as lamelas foram colocadas em hexano com 0,1% DDS durante 1,5 h com agitação suave. Depois de enxaguadas com hexano, as lamelas de cobertura foram filtradas em hexano durante 1 min, secas por um ventilador de ar, e armazenadas a -30 °C em condições secas. A câmara de fluxo foi montada por meio de dois pedaços de fita adesiva dupla face entre uma lamela não tratada e uma lamela revestida com DDS.
Para preparar uma amostra de observação, após lavagem da câmara com tampão de ensaio (5 mM HEPES-NaOH pH 7,8, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 500 μM EGTA), 0,2 mg ml-1 biotinylated BSA (ThermoFisher) foi adicionado à câmara e incubado durante 3 min. Após lavagem com tampão de ensaio, 0.Adicionou-se 2% de Tween-20 (Sigma-Aldrich) à câmara, que foi então incubada durante 10 min 0,2 mg ml-1 de NeutraAvidina (ThermoFisher) solução, 5 μg ml-1 20% de filamento de actina biotinilatada, e ~100 pM de origami de ADN vareta-Myosin-GNP foram adicionados à câmara em série enquanto se lavavava a câmara com tampão de ensaio. A câmara foi então incubada durante 3 min. de tampão de ensaio (0,11 mg ml-1 de glucose oxidase, 18 μg ml-1 de catalase, 2,3 mg ml-1 de glucose, e 0,5% de 2-mercaptoetanol em tampão de ensaio), incluindo o ATP, foi então selado com verniz de unhas e observado sob um microscópio a 27 ± 1 °C. As trajectórias foram analisadas utilizando inferência Bayesiana não paramétrica (Fig. 6a) sobre dados de experiências realizadas a 19 ± 0,5 °C. Nas experiências ATP fluorescentes, foi adicionado ao tampão de imagem, em vez de ATP.
h3>Microscopia de campo escuro do tipo evanescente do tipo abjectivop>GNP foi realizado com um sistema MicroMirror TIRF (Mad City Labs)37,49. Um esquema da configuração óptica é mostrado na figura suplementar 3. A iluminação foi fornecida por um laser de 532 nm (2 W de potência nominal, Coherent Genesis CX) e focada no plano focal posterior da objectiva (Olympus, ×60, NA = 1,49, óleo) por uma lente de 250 mm de distância focal através de um micromirror. O laser de retorno foi direccionado para um fotodíodo quadrante e utilizado num sistema de focagem automática (TIRF Lock, Mad City Labs). A densidade de potência medida na amostra foi de ~2,5 kW cm-2 no máximo nas experiências. Considerando que um aumento da temperatura provoca absorção de luz pelo GNP50, concluímos que o efeito de aquecimento era negligenciável. As imagens dispersas e fluorescentes foram separadas por um espelho dicróico (FF562-Di02-25 × 36) e adquiridas por câmaras CMOS a 25.000 fps, 123 nm por pixel e 384 × 256 pixels por fotograma (FASTCAM mini AX100, Photoron), e a 200 fps, 160 nm por pixel e 1024 × 512 pixels por fotograma (ORCA-Flash4.0, Hamamatsu photonics). Um filtro de emissão (FF01-593/40-25) foi posicionado no caminho fluorescente. A imagem fluorescente foi utilizada para observar o ATP fluorescente (Fig. 5). Para medir os tempos de espera do ATP (Suplemento Fig. 6a, b), as imagens foram adquiridas a 1000 fps por AX100.
Análise de dados de imageamento
As imagens de GNP foram rapidamente localizadas por simetria radial com base no método de localização de partículas51 (o software está disponível na referência) e rastreadas para excluir GNPs que mostravam comportamento imprevisível da geometria do complexo (Suplemento Fig. 5). Considerámos o PNB excluído para ligar de forma não específica à superfície do vidro ou não amarrar firmemente ao complexo de origami de DNA vara miosina-actin. Após a análise, os PNBs foram localizados pelo encaixe de distribuição gaussiano20, e a trajectória na direcção do eixo principal foi analisada por um método de inferência utilizando um modelo Markov oculto39 assumindo dois estados (estados de ligação e estados destacados). Estimámos o deslocamento causado pelo processo de geração de actomyosin a partir da distância inferida entre os dois estados (Fig. 4d).
Para avaliar estados ocultos no estado destacado, utilizámos a inferência Bayesiana não paramétrica baseada num modelo Markov oculto41, que é capaz de detectar estados moleculares ocultos sem definir previamente o número de estados. Descarregámos e utilizámos ficheiros Matlab, especialmente “iHmmNormalSampleBeam.m”, com as seguintes hipóteses. Primeiro, uma trajectória em cada estado era normalmente distribuída. Em segundo lugar, assumimos um estado separado e estados de ligação infinita, e que os estados de ligação partilham a mesma distribuição de emissões. Os desvios padrão das duas distribuições de emissões do estado destacado e dos estados de ligação foram fixados em 12,5 nm e 4,7 nm, respectivamente. Os valores fixos foram obtidos calculando os desvios-padrão de todos os pontos e os pontos dos estados de ligação forte nas trajectórias analisadas. Os dados utilizados para a inferência incluíram 10.000 pontos (400 ms). A probabilidade de transição de um estado de ligação para outro estado de ligação foi fixada em 0. Os estados inferidos cujos pontos eram <1% das trajectórias analisadas ou tinham tempos de permanência <40 μs foram excluídos da análise. Finalmente, as posições dos estados de ligação inferidos foram definidas como as posições relativas da posição destacada inferida. Realizámos a inferência 1000 vezes, na qual a iteração da cadeia de Markov algoritmo Monte Carlo foi definida para 1000 (Fig. 6a). Entre os estados inferidos, os estados cujas posições estavam dentro dos picos ± 1 SD foram utilizados para calcular a acessibilidade e o tempo de permanência na Fig. 7a. Para testar a exactidão da detecção, produzimos dados simulados assumindo 4 ou 8 estados de ligação transitórios e um estado destacado com os desvios padrão (12,5 nm e 4,7 nm) obtidos a partir dos dados experimentais, conforme descrito acima.
O curso temporal da intensidade de fluorescência do Cy3-EDA-ATP foi analisado para calcular o tempo de espera ATP. Resumidamente, o curso temporal foi adquirido calculando a intensidade média de uma região de interesse (ROI) de 7 × 7 pixels em cada fotograma. O centro do ROI foi definido pela imagem de dispersão do PNB ligada a um myosin. Foi efectuada uma correcção do ruído de fundo calculando a intensidade média do perímetro em torno do ROI52. Medimos o tempo de espera ajustando os dados a uma dupla decadência exponencial e definimos a taxa mais lenta como a taxa de ligação ATP, dando assim um ciclo ATPase completo53. A taxa de ligação ATP do Cy3-EDA-ATP foi corrigida à taxa de ATP normal por um factor de 2,854,
Preparação de camadas de lípidos suportados em mica-
Vesículas de lípidos foram preparadas a partir de uma reserva de clorofórmio de compostos lipídicos, misturando-as num tubo de vidro. Uma composição lipídica típica foi 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (DPPC) e 1,2-dipalmitoyl-3-trimetilamónio-propano (DPTAP) com uma relação de peso de 0,98:0,02. Em alguns casos, o conteúdo do DPTAP lipídico com carga positiva foi aumentado até 10%. O clorofórmio foi evaporado num exsicador de vácuo durante pelo menos 30 min. Os lípidos foram suspensos em água Milli-Q (concentração lipídica total 1 mg/ml). A suspensão lipídica foi vortexada e sonicada para produzir vesículas lipídicas multilamelares.
Biletes lipídicos suportados (SLBs) foram preparados a partir de vesículas lipídicas através do método de fusão de vesículas55. As vesículas lipídicas foram diluídas a 0,25 mg ml-1 pela adição de 10 mM de solução MgCl2. A solução de vesícula foi filtrada para obter pequenas vesículas unilamelares. Os SLBs foram formados depositando 2 µl de solução de vesícula em mica recém clivada numa fase de vidro (diâmetro, 1,5 mm) e incubando durante 10 min a 60 °C. Para evitar a secagem da amostra, a amostra foi incubada num recipiente selado, no interior do qual um pedaço de Kimwipe molhado com água Milli-Q foi encharcado.
Preparação da amostra para imagem AFM
Varas de DNA (10 nM) e miosina-oligonucleótidos (1 µM) foram incubados durante 30 min a 4 °C para formar conjugados de miosina-DNA com antecedência. Depois de enxaguar o substrato de bico lipídico com água Milli-Q e tampão A (10 mM HEPES-NaOH (pH 7,8), 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM EGTA) para remover vesículas não absorvidas, uma gota (2 µl) de conjugados de miosina ADN em tampão A foi depositada sobre os bicos de bico lipídico durante 5 min numa campânula húmida. Após enxaguamento com tampão A, uma gota (2 µl) de filamentos de actina (1 µM) em tampão A foi depositada sobre os bicos lipídicos durante 10 min numa campânula húmida. Após enxaguamento com uma solução contendo ATP (adenosina 5′-trifosfato, P3-(1-(2-nitrofenil) etil) (Invitrogénio) (0-1 µM) em tampão A, a amostra foi ligada à fase de varrimento de um aparelho HS-AFM e imersa na mesma solução (120 µl).
FM imagem de AFM de alta velocidade
FM imagem foi realizada utilizando um sistema HS-AFM (NanoExplorer, RIBM, Tsukuba, Japão) com um cantilever de nitreto de silício (frequência ressonante, 1,5 MHz no ar, constante de mola, 0,1 N m-1; Olympus BL-AC10DS-A2). Os conjugados de hastes de Myosin-DNA e filamentos de actina foram fracamente adsorvidos lateralmente na superfície do substrato contendo DPTAP. Para obter imagens de alta resolução de conjugados de barras de miosina ADN na presença de ATP, a área de varrimento foi reduzida (tipicamente para cerca de 300 × 150 nm2), e o número de pixels foi optimizado (100 × 50 pixels). A ATP engaiolada foi fotolisada utilizando uma fonte de luz de lâmpada de mercúrio (U-RFL-T, Olympus) e um filtro de percurso de banda (FF01-360/23-25, Semrock) durante a observação durante 30 s em média. A velocidade média de deslizamento dos filamentos de actina nas experiências AFM a 1 µM ATP engaiolado foi de 1,4 nm s-1. A julgar pela velocidade de deslizamento de actina no nosso ensaio de motilidade in vitro, a concentração final de ATP nas experiências de AFM foi estimada em cerca de 190 nM. As imagens de AFM foram analisadas utilizando o Eagle Software (RIBM, Tsukuba, Japão) e ImageJ. Todas as observações foram realizadas à temperatura ambiente.
Aplicámos a cada imagem de AFM um filtro Gaussiano para remover ruídos de picos e um filtro de achatamento para remover o efeito de inclinação do substrato. Cada posição do domínio motor do myosin foi determinada calculando o centro de massa para medir o deslocamento.
Estatistica e reprodutibilidade
Para experiências de imagem de alta velocidade e experiências AFM, realizámos as experiências pelo menos três vezes independentemente para obter os resultados consistentes. Os tamanhos dos passos de S1 sem alavanca e do tipo selvagem foram analisados estatisticamente pelos testes t de alunos de duas caudas. O número de experiências independentes, o nome do teste estatístico, o tamanho do efeito e os valores exactos de p são fornecidos em cada legenda das figuras. O tamanho do efeito (Hedges’ g) foi calculado pelo código MATLAB descarregado a partir da referência56. Considerámos um valor p< 0,05 uma diferença significativa entre os meios. O intervalo de p-valores é mostrado por asteriscos nos gráficos como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001.
Resumo do relatório
Outras informações sobre a concepção da investigação estão disponíveis no Resumo dos Relatórios de Investigação sobre a Natureza ligado a este artigo.
0 comentários