- Para estudar as diferentes fases de crescimento bacteriano.
- Para traçar curva de crescimento padrão de Staphylococcus aureus.
- para determinar o tempo de geração de determinada bactéria.
br> O aumento do tamanho e massa celular durante o desenvolvimento de um organismo é denominado crescimento. É a característica única de todos os organismos. O organismo deve exigir determinados parâmetros básicos para a sua geração de energia e biossíntese celular. O crescimento do organismo é afectado tanto por factores físicos como nutricionais. Os factores físicos incluem o pH, temperatura, pressão osmótica, pressão hidrostática e conteúdo de humidade do meio em que o organismo está a crescer. Os factores nutricionais incluem a quantidade de Carbono, azoto, enxofre, fósforo e outros oligoelementos fornecidos no meio de crescimento. As bactérias são organismos unicelulares (monocelulares). Quando as bactérias atingem um determinado tamanho, dividem-se por fissão binária, na qual uma célula se divide em duas, duas em quatro e continuam o processo de forma geométrica. Sabe-se então que a bactéria se encontra numa fase de crescimento activo. Para estudar a população de crescimento bacteriano, as células viáveis da bactéria devem ser inoculadas até ao caldo estéril e incubadas em condições óptimas de crescimento. A bactéria começa a utilizar os componentes dos meios e aumentará no seu tamanho e massa celular. A dinâmica do crescimento bacteriano pode ser estudada traçando o crescimento celular (absorvância) versus o tempo de incubação ou registo do número de células versus tempo. A curva assim obtida é uma curva sigmóide e é conhecida como uma curva de crescimento padrão. O aumento da massa celular do organismo é medido através da utilização do Espectrofotómetro. O Espectrofotómetro mede a turbidez ou densidade óptica, que é a medida da quantidade de luz absorvida por uma suspensão bacteriana. O grau de turbidez na cultura do caldo está directamente relacionado com o número de microrganismos presentes, células viáveis ou mortas, e é um método conveniente e rápido de medir a taxa de crescimento celular de um organismo. Assim, o aumento da turbidez do meio de caldo indica o aumento da massa celular microbiana (Fig 1). A quantidade de luz transmitida através do caldo turvo diminui com o subsequente aumento do valor da absorvância.
Fig 1: Leitura da absorção de suspensão bacteriana
A curva de crescimento tem quatro fases distintas (Fig 2)
1. Lag phase
Quando um microrganismo é introduzido no meio fresco, leva algum tempo a ajustar-se ao novo ambiente. Esta fase é denominada fase Lag, na qual o metabolismo celular é acelerado, as células estão a aumentar de tamanho, mas as bactérias não são capazes de se replicar e, portanto, não há aumento da massa celular. A duração da fase de atraso depende directamente da condição de crescimento anterior do organismo. Quando o microorganismo que cresce num meio rico é inoculado num meio nutricionalmente pobre, o organismo levará mais tempo a adaptar-se ao novo ambiente. O organismo começará a sintetizar as proteínas, co-enzimas e vitaminas necessárias para o seu crescimento e, portanto, haverá um aumento subsequente na fase de atraso. Do mesmo modo, quando um organismo de um meio nutricionalmente pobre é adicionado a um meio nutricionalmente rico, o organismo pode facilmente adaptar-se ao ambiente, pode iniciar a divisão celular sem qualquer atraso, e portanto terá menos fase de atraso que poderá estar ausente.
2. Fase exponencial ou logarítmica (log)
Durante esta fase, os microrganismos estão num estado de rápido crescimento e divisão. A sua actividade metabólica aumenta e o organismo inicia a replicação do ADN por fissão binária a um ritmo constante. O meio de crescimento é explorado à taxa máxima, a cultura atinge a taxa máxima de crescimento e o número de bactérias aumenta logaritmicamente (exponencialmente) e finalmente a célula única divide-se em duas, que se replicam em quatro, oito, dezasseis, trinta e dois e assim por diante (ou seja 20, 21, 22, 23……… 2n, n é o número de gerações), o que resultará num crescimento equilibrado. O tempo que a bactéria leva a duplicar em número durante um período de tempo especificado é conhecido como o tempo de geração. O tempo de geração tende a variar com diferentes organismos. E.coli divide em cada 20 minutos, daí o seu tempo de geração ser de 20 minutos, e para Staphylococcus aureus é de 30 minutos.
3. Fase estacionária
À medida que a população bacteriana continua a crescer, todos os nutrientes no meio de crescimento são utilizados pelo microrganismo para a sua rápida multiplicação. Isto resulta na acumulação de materiais residuais, metabolitos tóxicos e compostos inibidores, tais como antibióticos no meio. Isto altera as condições do meio, tais como pH e temperatura, criando assim um ambiente desfavorável para o crescimento bacteriano. A taxa de reprodução irá abrandar, as células em divisão é igual ao número de células mortas, e finalmente a bactéria pára completamente a sua divisão. O número de células não é aumentado e, assim, a taxa de crescimento é estabilizada. Se uma célula retirada da fase estacionária for introduzida num meio fresco, a célula pode deslocar-se facilmente na fase exponencial e é capaz de realizar as suas actividades metabólicas como habitualmente.
4. Declínio ou Fase de Morte
O esgotamento de nutrientes e a subsequente acumulação de resíduos metabólicos e outros materiais tóxicos nos meios de cultura facilitarão a passagem da bactéria para a fase de Morte. Durante esta, a bactéria perde completamente a sua capacidade de reprodução. As bactérias individuais começam a morrer devido às condições desfavoráveis e a morte é rápida e a um ritmo uniforme. O número de células mortas excede o número de células vivas. Alguns organismos que podem resistir a esta condição podem sobreviver no meio ambiente, produzindo endosporos.
Fig 2: Diferentes fases de crescimento de uma bactéria
CÁLCULO:
O tempo de geração pode ser calculado a partir da curva de crescimento(Fig 3).
Fig 3: Cálculo do tempo de geração
Os pontos exactamente duplicados das leituras de absorvância foram tomados e, os pontos foram extrapolados para cumprir o respectivo eixo temporal.
br> Tempo de geração = (Tempo em minutos para obter a absorvância 0,4) – (Tempo em minutos para obter a absorvância 0.2)
= 90-60
= 30 minutos
N.º de população inicial
br>Nt = população no tempo t
N = número de gerações no tempo t
Por isso,
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Por isso,
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A taxa de crescimento pode ser expressa em termos de taxa média de crescimento constante (k), o número de gerações por unidade de tempo.
br>Tempo de geração do delito ou tempo médio de duplicação (g), é o tempo necessário para duplicar o seu tamanho.
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