Última actualização em 26 de Janeiro de 2021 por Sagar Aryal
História da Microscopia: Visão Geral
- A evolução do campo da Microbiologia coloca em perspectiva a necessidade de identificar, visualizar, observar e compreender os microrganismos, incluindo as suas morfologias e mecanismos estruturais. O âmbito da Microbiologia é estudar organismos e agentes minúsculos que só podem ser examinados e observados com um microscópio.
- Embora cientificamente, o primeiro microscópio simples foi descoberto por dois cientistas holandeses, Zaccharias Janssen e o seu pai, Hans, que fazia óculos, foram os primeiros a experimentar as suas lentes combinando lentes num tubo e observaram que os objectos que se encontravam nas proximidades, pareciam mais próximos e maiores. Apesar de não ter sido incluído como uma descoberta científica, este acto abriu o caminho para a evolução científica.
li> Da História da Microbiologia, Antony Van Lewnehoueek, um Microbiólogo amador, fez o primeiro microscópio simples, que lhe permitiu observar a presença de minúsculos organismos vivos na água dos lagos que apareceram como pontos. O seu microscópio simples era constituído por uma lente dupla convexa de vidro que era mantida entre duas placas de prata.li> A aplicação do microscópio em Microbiologia melhorou a visualização de células e microrganismos ampliando as suas imagens para as tornar maiores.
O microscópio de luz é também conhecido como microscópio óptico.
O que é um microscópio de luz?
- Um microscópio de luz é um instrumento ou ferramenta de laboratório de biologia, que utiliza a luz visível para detectar e ampliar objectos muito pequenos, e ampliá-los.
- usam lentes para focar a luz no espécime, ampliando-o assim produzindo uma imagem. A amostra é normalmente colocada perto da lente microscópica.
- A ampliação microscópica varia muito dependendo dos tipos e número de lentes que compõem o microscópio. Dependendo do número de lentes, existem dois tipos de microscópios, ou seja, o microscópio de luz simples (tem uma ampliação baixa porque utiliza uma única lente) e o microscópio de luz composta (tem uma ampliação mais alta em comparação com o microscópio simples porque utiliza pelo menos dois conjuntos de lentes, uma lente objectiva, e uma ocular). As lentes estão alinhadas nesse sentido, podem ser capazes de dobrar a luz para uma ampliação eficiente da imagem.
li> O funcionamento do microscópio de luz baseia-se na sua capacidade de focar um feixe de luz através de uma amostra, que é muito pequena e transparente, para produzir uma imagem. A imagem é então passada através de uma ou duas lentes para ampliação para visualização. A transparência do espécime permite uma penetração fácil e rápida da luz. As amostras podem variar de bactérias a células e outras partículas microbianas.
Figura: Diagrama de Microscópios de Luz, criado com biorender.com
Princípio de um microscópio de luz (microscópio óptico)
Como mencionado anteriormente, os microscópios de luz visualizam uma imagem utilizando uma lente de vidro e a ampliação é determinada pela capacidade da lente de dobrar a luz e focá-la na amostra, que forma uma imagem. Quando um raio de luz passa através de um meio para outro, o raio dobra-se na interface causando refracção. A curvatura da luz é determinada pelo índice de refracção, que é uma medida de quão grande é uma substância que abranda a velocidade da luz. A direcção e magnitude da curvatura da luz são determinadas pelos índices de refracção dos dois meios que formam a interface.
Um meio com um índice de refracção inferior, como o vidro ao ar, normalmente acelera a penetração da luz e faz com que a luz se afaste do normal e quando a luz passa através de um meio com um índice de refracção maior, como o ar ao vidro, normalmente abranda e inclina-se para o normal, perpendicularmente à superfície.
Se um objecto for colocado entre estes dois meios, ou seja, entre a água e o ar, neste caso, um prisma, o prisma dobrará a luz num ângulo. É assim que as lentes microscópicas funcionam, elas dobram a luz num ângulo. A lente (convexa) ao receber os raios de luz, foca os raios num ponto específico conhecido como o ponto focal (ponto F). A medida da distância do centro da lente e do ponto focal é conhecida como distância focal.
Um microscópio utiliza lentes cuja força é pré-determinada, na medida em que, a força de uma lente está directamente relacionada com a distância focal, ou seja, a distância focal curta amplia mais os objectos do que as lentes com uma distância focal longa.
Microscopia funciona estritamente com um factor de resolução em que a resolução é a capacidade de uma lente ser capaz de diferenciar pequenos objectos que estão intimamente embalados. A resolução de um microscópio de luz é determinada por uma abertura numérica do seu sistema de lentes e pelo comprimento de onda da luz que emprega; uma abertura numérica uma definição dos comprimentos de onda de luz produzidos quando a amostra é iluminada.
Uma distância mínima (d) entre dois objectos que distingue então duas entidades separadas, determinadas pelos comprimentos de onda da luz, pode ser calculada por uma equação Abbe usando o comprimento de onda da luz que iluminou a amostra (Lambda, λ) e a abertura numérica (NA, n sin Ɵ) i.e. d=0,5 λ/n sin Ɵ
Tipos de microscópios de luz (microscópio óptico)
Com o campo evoluído da Microbiologia, os microscópios
utilizados para visualizar as amostras são microscópios de luz simples e compostos, todos utilizando lentes. A diferença é que os microscópios de luz simples utilizam uma única lente para ampliação, enquanto as lentes compostas utilizam duas ou mais lentes para ampliações. Isto significa que uma série de lentes é colocada numa ordem tal que, uma lente amplia a imagem mais do que a lente inicial.
Os tipos modernos de Microscópios de Luz incluem:
- Microscópio de Luz de Campo Brilho
- Microscópio de Luz de Contraste Fase
- Dark-Microscópio de Luz de Campo
- Microscópio de Luz de Flúor
Microscópio de Luz de Campo Brilho (Microscópio de Luz Composta)
- Este é o Microscópio óptico mais básico utilizado em laboratórios de microbiologia que produz uma imagem escura contra um fundo brilhante. Composto por duas lentes, é amplamente utilizado para visualizar organelas de células vegetais e animais, incluindo alguns parasitas como o Paramecium após coloração com manchas básicas.
- A funcionalidade do Its baseia-se na capacidade de fornecer uma imagem de alta resolução, o que depende muito da utilização adequada do microscópio. Isto significa que uma quantidade adequada de luz permitirá uma focalização suficiente da imagem, para produzir uma imagem de qualidade.
- É também conhecido como microscópio de luz composta.
Partes de um microscópio de campo brilhante (microscópio de luz composta)
Figura criada com biorender.com
É composto por:
- Duas lentes que incluem a lente objectiva e a ocular.
- Li>Li>Lente objectiva é composta por seis ou mais óculos, que tornam a imagem clara do objecto
- O condensador é montado abaixo da fase que foca um feixe de luz sobre a amostra. Pode ser fixo ou móvel, para ajustar a qualidade da luz, mas isto depende inteiramente do microscópio.
- são mantidos juntos por uma parte posterior metálica curvada resistente usada como braço e um suporte no fundo, conhecido como a base, do microscópio. O braço e a base seguram todas as partes do microscópio.
- O estágio onde a amostra é colocada, permitindo o movimento da amostra em redor para melhor visualização com os botões flexíveis e é onde a luz é focada.
- Dois botões de focagem i.e o botão de ajuste fino e o botão de ajuste grosso, encontrado no braço do microscópio, que pode mover o palco ou o nariz para focar a imagem. a nitidez da imagem é nítida.
- Tem um iluminador de luz ou um espelho encontrado na base ou nos micróbios do nariz.
- O nariz tem cerca de três a cinco lentes objectivas com diferentes potências de ampliação. Pode mover-se para qualquer posição dependendo da lente objectiva para focar a imagem.
- Um diafragma de abertura também é conhecido como o contraste, que controla o diâmetro do feixe de luz que passa através do condensador, na medida em que, quando o condensador está quase fechado, a luz passa para o centro do condensador criando um elevado contraste. Mas quando o condensador está amplamente aberto, a imagem é muito brilhante com muito baixo contraste.
Magnificação por Microscópio de Campo Brilhante (Microscópio de Luz Composta)
Durante a visualização, a lente objectiva permanece parfocal, o que significa que, quando a lente objectiva é alterada, a imagem ainda permanece em foco. A lente objectiva desempenha um papel importante na focalização da imagem no condensador formando uma imagem clara ampliada dentro do microscópio, que é depois ampliada pela ocular para uma imagem primária.
O que é visto no microscópio como uma imagem clara ampliada do espécime é conhecido como a imagem virtual. Para calcular a ampliação, multiplicar a objectiva e a ampliação da objectiva ocular em conjunto. A ampliação é padrão, ou seja, não demasiado alta nem demasiado baixa, e por conseguinte, dependendo do poder de ampliação das lentes, variará entre 40X e 100oX.
Cálculo da ampliação = Ampliação da lente da objectiva/magnificação da lente ocular
A lente da objectiva desempenha um papel vital não só na ampliação da imagem, mas também em torná-la clara para visualização, uma característica conhecida como resolução. Resolução de acordo com Prescott, é a capacidade de uma lente para separar ou distinguir entre pequenos objectos intimamente ligados entre si.
Quando a lente ocular aumenta a imagem no fim da visualização, a sua amplitude de ampliação é inferior à da lente da objectiva a 8X-12X (padrão 10X) e a da lente da objectiva a 40X-100X, a ampliação, e a resolução do microscópio é altamente dependente da lente da objectiva.
Aplicações do Microscópio de Luz de Campo Brilhante (Microscópio de Luz Composta)
Muito utilizado em Microbiologia, este microscópio é utilizado para visualizar espécimes fixos e vivos, que foram corados com manchas básicas. Isto dá contraste para uma fácil visibilidade sob o microscópio. Por conseguinte, pode ser utilizado para identificar células bacterianas básicas e protozoários parasitas como o Paramecium.
Folha de Trabalho Sem Microscópio Ligeiro
Chave de Resposta
Microscópio de Contraste Fásico
- Este é um tipo de microscópio óptico em que pequenos desvios de luz conhecidos como deslocamentos de fase ocorrem durante a penetração da luz na amostra não manchada. Estes desvios de fase são convertidos na imagem para significar que, quando a luz passa através da amostra opaca, os desvios de fase iluminam a amostra formando uma imagem iluminada (brilhante) no fundo.
- O microscópio de contraste de fase produz imagens de alto contraste quando se utiliza uma amostra transparente, mais para as de culturas microbianas, fragmentos de tecido fino, tecidos celulares, e partículas subcelulares.
- O princípio por detrás do trabalho do microscópio de contraste de fase é a utilização de um método óptico para transformar uma amostra numa imagem de amplitude, que é vista pela ocular do microscópio.
- O PCM pode ser utilizado para visualizar células não manchadas também conhecidas como objectos de fase, o que significa que a morfologia da célula é mantida e as células podem ser observadas no seu estado natural, com elevado contraste e clareza eficiente. Isto porque se as amostras forem manchadas e fixadas, matam a maioria das células, uma característica que é unicamente desfeita pelo microscópio de luz de campo brilhante.
- Acoplados com elementos que aumentam o contraste, tais como a fluorescência, produzem melhores visuais da imagem das amostras.
li>As mudanças que ocorrem durante a penetração da luz, tornam-se convertidas em mudanças de amplitude que causam o contraste da imagem.
Partes do Microscópio de Contraste de Fase
A instrumentação do Microscópio de Contraste de Fase baseia-se nas suas vias de luz desde a recepção da fonte de luz até à visualização da imagem.
Por isso, é composto sequencialmente:
- Fonte de luz (lâmpada de arco de mercúrio)
- Lente colectiva
- Apertura
- Condensador
- Anular condensador
- Espécimen
- Objectivo
- Placa de fase
- Li>Luz deflectida
- Anel fase
O funcionamento do microscópio de contraste de fase
- A alteração causada pelo desvio da luz dispersa (Deflectida) e a luz não revelada que atinge o espécime que é absorvido, criar a um determinado comprimento de onda, produzindo cor. A diferença criada pela luz dispersa e a da luz absorvida é conhecida como variações de amplitude. Estas variações de amplitude são sensíveis a permitir a visualização por equipamento fotográfico como o Microscópio de Contraste de Fase, portanto visto pelo olho humano.
li> O Condensador do microscópio de contraste de fase tem um disco opaco que é conhecido como anel anular, com um anel transparente que produz um cone de luz, que passa através de um espécime. Devido a variações da luz, alguma luz curva na amostra, causada por variações na densidade da luz, formando uma imagem na lente objectiva. A luz não revelada atingirá o anel de fase na placa de fase e a luz desviada falhará o anel de fase que passa directamente pela placa de fase, formando uma imagem.
O microscópio de contraste de fase é concebido com lentes objectivas que têm a capacidade de executar múltiplas funções quando combinadas com técnicas de realce de contraste, por exemplo, fluorescência. As lentes objetivas estão localizadas na placa de fase interna com variação na absorção de luz e deslocamento de fase, ou seja, sem difracção, criando um largo espectro para contrastar a amostra e formando um forte contraste no fundo.
Aplicações do microscópio de contraste de fase
- Determinar morfologias de células vivas tais como células vegetais e animais
- Estudar a motilidade microbiana e estruturas de locomoção
- Detectar certos elementos microbianos tais como os endosporos bacterianos
Dark-Microscópio de Luz de Campo
Este é um tipo especializado de microscópio de luz de campo brilhante que tem várias semelhanças com o Microscópio de Fase de Contraste. Para fazer um microscópio de campo escuro, colocar uma paragem de campo escuro por baixo e uma lente condensadora que produz um feixe cônico oco de luz que entra apenas no objectivo, a partir da amostra (Prescott, pg 22).
Esta técnica é utilizada para visualizar células vivas não manchadas. Isto é efectuado pela forma como a iluminação é feita na amostra, na medida em que, quando um feixe de luz cônico oco é transmitido à amostra, os raios de luz desviados (não reflectidos/não refractados) não passam através das objectivas mas a luz não revelada (reflectida/refractada) passa através das objectivas para a amostra formando uma imagem.
Isto faz com que o campo circundante da amostra pareça preto enquanto a amostra aparecerá iluminada. Isto é possibilitado pelo fundo escuro este o nome, Microscopia de campo escuro.
Aplicações do Microscópio de Campo Escuro
- É utilizado para visualizar os órgãos internos de células maiores, tais como as células eucarióticas
- Identificação de células bacterianas com formas distintas, tais como Treponema pallidum, um agente causador da sífilis.
O Microscópio Fluorescente
Os microscópios acima referidos produzirão normalmente imagens depois de uma luz ter sido transmitida e passada através da amostra.
No caso do Microscópio Fluorescente, a amostra emite luz. Como? Adicionando uma molécula de corante ao espécime. Esta molécula de corante ficará normalmente excitada quando absorve energia luminosa, libertando assim qualquer energia retida como luz. A energia da luz que é libertada pela molécula excitada tem um longo comprimento de onda em comparação com a sua luz irradiante. A molécula corante é normalmente um fluorocromo, que fluoresce quando exposta à luz de um determinado comprimento de onda específico. A imagem formada é uma imagem marcada com fluorocromo a partir da luz emitida
O princípio por detrás deste mecanismo de trabalho é que o microscópio fluorescente irá expor a amostra à luz ultra ou violeta ou azul, que forma uma imagem da amostra que é emanada pela luz fluorescente. Têm uma lâmpada de arco de vapor de mercúrio que produz um feixe intenso de luz que passa através de um filtro excitador. O filtro excitador funciona para transmitir um comprimento de onda específico à amostra corada com fluorocromo, produzindo a imagem marcada com fluorocromo, na objectiva.
Após a objectiva, existe um filtro de barreira que funciona principalmente para remover qualquer radiação ultravioleta que possa ser prejudicial à luz do espectador, reduzindo assim o contraste da imagem.
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Figura criada com biorender.com
Aplicações do Microscópio Fluorescente
- Utilizado na visualização de agentes bacterianos tais como Mycobacterium tuberculosis.
- Utilizado para identificar anticorpos específicos produzidos contra antigénios/patógenos bacterianos em técnicas de imunofluorescência através da rotulagem dos anticorpos com fluorocromos.
- Utilizado em estudos ecológicos para identificar e observar microrganismos rotulados pelos fluorocromos
- Pode também ser utilizado para diferenciar entre bactérias mortas e vivas pela cor que emitem quando tratadas com manchas especiais
Além dos microscópios acima referidos, existe um microscópio não comummente utilizado conhecido como Microscopia de Contraste de Interferência Diferencial. É muito semelhante ao microscópio de contraste de fase em que as imagens são formadas a partir das variações da luz desviadas e ou não desviadas. A diferença é que aqui dois feixes de luz são emitidos para o espécime e focalizados por um prisma. Um feixe passa através do prisma para o espécime, enquanto outro passa através da área transparente da lâmina de vidro sem o espécime. Os dois feixes combinam-se então e interferem um com o outro para formar uma imagem. Pode ser utilizado para visualizar estruturas celulares tais como endosporos, paredes celulares bacterianas, núcleos e grânulos para espécimes não manchados.
- Microbiologia por Laning M. Prescott, 5ª Edição
- https://science.umd.edu/CBMG/faculty/wolniak/wolniakmicro.html
- https://en.wikipedia.org/wiki/Bright-field_microscopy
- https://sciencing.com/calculate-magnification-light-microscope-7558311.html
- https://www.microscopemaster.com/brightfield-microscopy.html
- https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-contrast_microscopy
- https://www.microscopyu.com/techniques/phase-contrast/introduction-to-phase-contrast-microscopy
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/phasecontrast/phase/
- https://laboratoryinfo.com/types-of-microscopes/
Fontes da Internet
- 1% – https://www.youtube.com/watch?v=zLxdiRpz77c
- 1% – https://www.slideshare.net/raiuniversity/b-sc-micro-i-btm-u-1-microscopy-and-staining
- 1% – https://quizlet.com/34169032/microbiology-chapter-2-microscopy-flash-cards/
- <
1% – https://www1.curriculum.edu.au/sciencepd/readings/ligh_refraction.htm
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