Formação de biofilme em dispositivos intrauterinos em pacientes com candidíase vulvovaginal recorrente

Abstract

Um biofilme é uma comunidade complexa de células associadas à superfície encerradas numa matriz de polímeros. Fixam-se a superfícies sólidas e a sua formação pode ser afectada por condições de crescimento e co-infecção com outros agentes patogénicos. A presença do biofilme pode proteger os microrganismos das defesas do hospedeiro, bem como reduzir significativamente a sua susceptibilidade aos agentes antifúngicos. Os micróbios patogénicos podem formar biofilmes nas superfícies inertes dos dispositivos implantados, tais como cateteres, válvulas cardíacas protéticas e dispositivos intra-uterinos (DIUs). O presente estudo foi realizado para analisar a presença de biofilme na superfície de dispositivos intrauterinos em pacientes com candidíase vulvovaginal recorrente, e para determinar o perfil de susceptibilidade das leveduras isoladas à anfotericina B e ao fluconazol. A Candida albicans foi recuperada dos DIUs e verificou-se que era susceptível aos agentes antifúngicos quando testada sob condições de crescimento planctónico. Estes resultados indicam a presença do biofilme na superfície do DIU como um importante factor de risco para a candidíase vulvovaginal recorrente.

Introdução

Biofilme é uma estrutura complexa que pode ser produzida por vários microorganismos, incluindo membros do género Candida. A sua produção varia de acordo com o ambiente e o substrato disponível. Os biofilmes fixam-se a superfícies sólidas e a sua formação pode ser afectada pelas condições de crescimento e co-infecção com outros microrganismos . A presença de biofilmes pode servir de reservatório de microrganismos, e pode também levar à resistência a agentes antimicrobianos . Embora os biofilmes bacterianos tenham sido estudados em pormenor , houve poucos estudos de biofilmes fúngicos medicamente relacionados . Os dispositivos intra-uterinos (DIUs) são o método mais comummente utilizado para prevenir a fertilização . O presente artigo descreve dois casos de pacientes com sinais e sintomas de candidíase vulvovaginal recorrente (RVVC) que utilizaram DIUs como método contraceptivo. Após a sua remoção, o DIU foi analisado quanto à presença de biofilme nas suas superfícies, e o padrão de susceptibilidade das leveduras recuperadas dos dispositivos foi investigado.

Materiais e métodos

Patientes

Dois pacientes com sinais e sintomas sugestivos de CVR, definidos por pelo menos quatro episódios sintomáticos em 1 ano, foram inscritos no presente estudo após a obtenção da aprovação do Conselho de Revisão Institucional. Foram realizados estudos microbiológicos no Hospital da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.

Caso 1

A paciente tinha 29 anos de idade, casada, com dois filhos e apresentava sintomas clínicos sugestivos de VVR (presença de corrimento vaginal, prurido vulvar, comichão e eritema). Foi considerada negativa para a infecção pelo VIH e diabetes mellitus. A paciente tinha usado o DIU durante três anos e um mês como método contraceptivo e relatou que os sintomas tinham começado logo após a implantação do dispositivo. Estes sintomas tinham-se intensificado durante o último ano, principalmente em termos de prurido e descarga. A paciente mencionou que em várias visitas ginecológicas anteriores tinha sido tratada com fluconazol. Durante o seu actual exame ginecológico, foi recolhida uma amostra da secreção da vagina da paciente com esfregaços esterilizados das paredes laterais da vagina e do fundo do saco vaginal, com a ajuda de um espéculo não lubrificado. O material clínico foi colhido recentemente para exame imediato em 3 ml de solução salina estéril (NaCl 0,85%). As secreções vaginais foram preparadas nas superfícies de duas lâminas esterilizadas para coloração Gram-stain. Os esfregaços vaginais foram inoculados directamente em placas de Petri contendo Sabouraud dextrose agar medium (Difco, Detroit, EUA), bem como em placas de Petri contendo CHROMagar Candida (Paris, França) a fim de facilitar o isolamento de Candida spp. Todas as culturas foram incubadas durante 10 dias a 37°C. O DIU foi retirado do paciente após exames ginecológicos e laboratoriais. A remoção do DIU foi realizada em condições anti-sépticas e foi realizada sem que o DIU tocasse na parede vaginal ou no instrumento de abertura para evitar a contaminação pela flora vaginal. Imediatamente após a remoção do DIU, a paciente foi tratada oralmente com uma única dose de 150 mg de fluconazol. Três meses após a remoção do DIU, a paciente voltou para um segundo exame ginecológico onde não apresentou sinais ou sintomas sugestivos de RVVC e os exames laboratoriais de secreções vaginais foram negativos para leveduras.

Caso 2

A paciente tinha 38 anos de idade, casada, e apresentava sintomas clínicos sugestivos de RVVC (presença de corrimento vaginal com aspecto rugoso, queijo cottage, prurido vulvar e comichão). Também ela foi considerada negativa para o VIH e diabetes mellitus. A paciente relatou que a corrimento e comichão se tinham agravado nos últimos dois anos. Ela tinha usado um DIU durante cerca de cinco anos como método contraceptivo. A paciente mencionou que em visitas ginecológicas anteriores tinha sido tratada com fluconazol. Durante o exame ginecológico, as secreções vaginais foram recolhidas com esfregaços esterilizados com a ajuda de um espéculo não lubrificado. O material clínico foi colhido recentemente para exame imediato em 3 ml de solução salina estéril (NaCl 0,85%). As secreções vaginais foram preparadas nas superfícies de duas lâminas esterilizadas para coloração de Gram-stain. Os esfregaços vaginais foram inoculados directamente em placas de Petri contendo meio de ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, EUA), bem como em placas de Petri contendo CHROMagar Candida (Paris, França), a fim de facilitar o isolamento de Candida spp. Todas as culturas foram incubadas durante 10 dias a 37°C. Após os exames clínicos e laboratoriais, o DIU foi removido em condições anti-sépticas e examinado por microscopia electrónica de varrimento. A remoção foi realizada sem tocar o DIU à parede vaginal ou ao instrumento de abertura para evitar a contaminação pela flora vaginal. Imediatamente após a remoção do DIU, a paciente foi tratada oralmente com uma única dose de 150 mg de fluconazol. Três meses após a remoção do DIU, a paciente voltou para um segundo exame ginecológico, onde não apresentou sinais ou sintomas sugestivos de RVVC e os exames laboratoriais de secreção vaginal foram negativos para leveduras.

Isolamento e identificação das leveduras

As leveduras isoladas das amostras de secreção das pacientes foram identificadas com base na produção de germes em soro de bezerro fetal a 37°C durante 2 h, produção de chamidósporos em ágar de farinha de milho (Oxoid) contendo Tween 80 (Sigma) de acordo com o método Dalmau, assimilação de fontes de carbono, como recomendado por Kurtzman e Fell, 1998 e a utilização do teste comercial API 20C AUX kit (bioMérieux). Para efeitos comparativos, Candida dubliniensis, os isolados foram estriados na superfície da placa de ágar SDA (Difco, Detroit, MI, EUA) e incubados a 42°C, como descrito anteriormente. Todos os isolados que foram recuperados foram sugestivos de Candida albicans e para confirmar esta identificação, foram realizados estudos de PCR como descrito anteriormente com o primer oligonucleótido específico da espécie CAL5 (5′ TGT TGC TCT CTG GGG GGC GGC CG 3′) e NL4CAL (5′ AAG ATC ATT ATG CCA ACA TCC TAG GTA AA 3′) primer invertido para Candida albicans confirmado. Como controlo foi utilizada a estirpe 90028 da American Type Culture Collection (ATCC) Candida albicans. O método PCR utilizado foi realizado de acordo com o descrito por Mannarelli e Kurtzman .

Microscopia electrónica de varrimento

Os IDUs foram lavados com água estéril para remover células de levedura não aderentes. Os biofilmes formados nas UDI foram fixados com 2,5% (v/v) de glutaraldeído em 0,15 M PBS durante 1 h à temperatura ambiente. Foram depois tratados com 1% (p/v) de tetroxido de ósmio durante 1 h, lavados três vezes com água destilada, tratados com 1% (p/v) de acetato de uranilo durante 1 h e lavados novamente com água destilada. As amostras foram então desidratadas em etanol. Todas as amostras foram secas até ao ponto crítico, submetidas a metalização em camada de ouro, e foram feitas observações com o microscópio electrónico de varrimento JEOL-JSM 6100 (Jeol Ltda, Tokyo, Japão) no Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, Brasil.

Testes de susceptibilidade

Os agentes antifúngicos utilizados neste estudo foram a anfotericina B (Sigma, St. Louis MO, EUA) e fluconazol (Pfizer Central Research, Nova Iorque, EUA). Os testes de susceptibilidade foram realizados como descrito no documento M27-A3 . As soluções de reserva foram preparadas em água (para fluconazol) e dimetil sulfóxido (para anfotericina B). Outras diluições de cada agente antifúngico foram preparadas com RPMI 1640 glicose média 0,2% (Sigma) que tinha sido tamponada para pH 7,0 com ácido morfolinopropanossulfónico 0,165 M (Sigma), com L-glutamina e vermelho fenol, como descrito no documento M27-A3 (2008). As diluições da droga (contendo o dobro da concentração final) foram distribuídas em placas de microdiluição de 96 poços que foram seladas e armazenadas congeladas a -70°C até ao dia do teste. As leveduras foram subsequentemente subcultivadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco), durante 24 h a 35°C antes do teste de susceptibilidade antifúngica. O inóculo foi preparado para análise espectrofotométrica, realizada a 530 nm, e a concentração final do inóculo de levedura foi de 0,5×103 a 2,5×103 UFC/ml. As placas foram incubadas a 35°C durante 48 h numa incubadora não CO2. Os critérios interpretativos para a concentração inibitória mínima (MIC) no teste de susceptibilidade foram os publicados no documento M27-A3 (2008).

Resultados

O primeiro exame laboratorial da secreção vaginal da paciente 1 não revelou a presença de células de levedura, micélios ou tricomonas móveis no monte húmido. O exame microscópico dos esfregaços vaginais manchados de Gram-sheastos indicou a presença de leveduras com blastoconidia e pseudomicélios (Fig. 8A). A Candida albicans foi identificada por técnicas fenotípicas e confirmada por métodos de PCR. O primeiro exame laboratorial da secreção vaginal da paciente 2 não revelou a presença de células de levedura e tricomonas móveis. O exame de esfregaços de Gram-stained demonstrou a presença de leveduras com blastoconidia (Fig. 8B), que foram posteriormente identificadas como Candida albicans, confirmadas pelo método PCR. Após a remoção dos DIUs, as leveduras não puderam ser encontradas nos segundos exames laboratoriais de secreções vaginais de ambos os pacientes. Os resultados dos testes de susceptibilidade in-vitro sob condições planctónicas das duas estirpes de Candida albicans recuperadas como parte dos primeiros exames laboratoriais revelaram que elas eram susceptíveis aos agentes antifúngicos testados. Os MIC da estirpe isolada do paciente 1 foram 0,25 µg/ml para a anfotericina B e 0,5 µg/ml para o fluconazol. Os MIC do isolado do doente 2 foram 0,5 µg/ml para a anfotericina B e 2,0 µg/ml para o fluconazol. A figura 1 mostra o dispositivo intra-uterino do doente 1 antes da microscopia electrónica de varrimento. O exame revelou um biofilme heterogéneo aderente (Figs. 2A, 2B, 3 e 4) na superfície da bobina de cobre do DIU. A análise do biofilme revelou a presença de uma grande variedade de tipos morfológicos de bactérias que estavam embutidos numa matriz fibrosa (Fig. 3), com vários tipos de células – leucócitos polimorfonucleares e fibrina. Foram também observadas leveduras aderentes na superfície do biofilme (Fig. 4). Figs. 5-7 mostram os resultados microscópicos electrónicos de varrimento com o DIU do paciente 2. Mais uma vez, foi observada uma grande variedade de tipos morfológicos de células e microrganismos, incorporados numa matriz fibrosa presente na superfície da bobina superior. A figura 6 mostra um grande agregado de células e microrganismos misturados no DIU, enquanto que a figura 7 também mostra a levedura presente na superfície da bobina superior do paciente 2.

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Este artigo foi publicado pela primeira vez online no Early Online a 7 de Abril de 2009.