Cultura alargada até à fase blastocisto: uma estratégia para evitar gravidezes múltiplas em tecnologias de reprodução assistida

Biol Res 44:195-199, 2011

Cultura alargada até à fase blastocisto: uma estratégia para evitar gravidezes múltiplas em tecnologias de reprodução assistida

Soledad J Sepúlveda, Jimmy R Portella, Luis P Noriega, Ernesto L Escudero & Luis H Noriega

PRANOR Assisted Reproduction Group.

ABSTRACT

O objectivo deste estudo foi rever a experiência e os resultados dos ciclos de reprodução assistida com embriões cultivados até ao quinto dia de desenvolvimento, comparando diferentes parâmetros de acordo com as idades dos pacientes.

Estudámos retrospectivamente 1.874 ciclos de reprodução assistida em que a cultura de embriões foi estendida até ao quinto ou sexto dia de desenvolvimento. Todos os ciclos de FIV e ICSI foram incluídos, comparando, de acordo com a idade das pacientes, as seguintes taxas: formação de blastocistos, gravidez, implantação e aborto. Como controlo, analisámos ciclos com oócitos doados por jovens doadores (DO). O número de embriões que atingem a fase blastocisto é semelhante em todos os grupos de pacientes. Apenas o grupo de DO era diferente em termos de formação de blastocistos, gravidez e taxas de implantação. As pacientes com mais de 39 anos de idade tiveram uma taxa de aborto de 59,1%, que é significativamente mais elevada do que os outros grupos.

Cultura de embriões alargada até à fase blastocisto pode ser implementada em programas de reprodução assistida a fim de aumentar a taxa de gravidez. O potencial de implantação de blastocistos é elevado, permitindo-nos transferir menos embriões e reduzir a probabilidade de gravidez múltipla.

Palavras-chave: blastocisto, cultura a longo prazo, taxa de gravidez, taxa de implantação.

INTRODUÇÃO

O desafio das técnicas de reprodução assistida (ART) é evitar gravidezes múltiplas, que poderiam ser causadas pelo elevado número de embriões transferidos. Portanto, espera-se que o objectivo seja transferir apenas um embrião, mas bem seleccionado. Em geral, os laboratórios de reprodução assistida seleccionam os embriões a serem transferidos com base na morfologia, uma vez que é a única ferramenta simples. Contudo, a boa morfologia nem sempre está relacionada com o resultado do embrião e pode envolver múltiplas aneuploidias.

Na última década, foram desenvolvidos sistemas de cultura que permitem um desenvolvimento alargado até à fase blastocisto e, posteriormente, a selecção dos melhores embriões a serem transferidos (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). Contudo, o desenvolvimento humano precoce é ineficiente e apenas alguns zigotos atingirão a fase de blastocisto e de implantação. Portanto, um embrião que se desenvolve até à fase blastocisto sofre uma selecção espontânea durante a cultura in vitro.

Formação de blastocisto

Após a passagem pelo tubo, o embrião é uma mórula. Nos blastómeros periféricos, são estabelecidas junções apertadas que selam o espaço entre as células exteriores que formam os trofoblastos. A selagem impede a difusão de material intercelular no espaço extra-embrionário e assim a cavidade do blastocoel é formada. A mórula, composta de um tipo unicelular, é transformada em blastocisto, onde os tipos de duas células podem ser reconhecidos. Os blastocistos periféricos formam um epitélio achatado chamado trofoblasto, e os blastocistos centrais formam a massa celular interna. Estas células dão origem ao próprio embrião e a parte dos anexos embrionários. O trofoblasto dá origem à maioria dos anexos. O blastocisto humano expandido contém mais de 90 células, das quais cerca de 10% formam a massa celular interna (figura 1) (Sepúlveda, 2008).

A cavidade blastocoel é formada pela confluência de vacúolos. Cresce pela acção do Na+ / K+ ATPase localizado na membrana das células trofoblasto. Os iões Na+ entram na cavidade, que começa a incorporar água para manter o equilíbrio osmótico. O movimento da água durante a cavitação também pode ser facilitado por aquaporinas nas membranas apicais e basolaterais do trofotórax (Barcroft et al., 2003). Assim, a cavidade expande-se e começa a eclodir, após o que o embrião adere à superfície do endométrio, invadindo e fazendo contacto com o sistema vascular da mãe durante a implantação. Este procedimento pode demorar alguns dias e passa pelas fases ilustradas na Figura 1. Primeiro, forma-se um blastocisto precoce, com uma pequena cavidade, que cresce até formar um blastocisto completo. A partir desta fase, começamos a categorizar o número de células no trofoblasto e na massa celular interna. Começa a expansão e finalmente a eclosão através da zona pelúcida (Figura 1). Esta classificação permite seleccionar blastocistos para transferência que têm maior potencial de crescimento. A lógica subjacente à extensão da cultura embrionária até ao quinto dia não é melhorar a sua qualidade, mas aumentar a probabilidade de escolher o embrião com melhor potencial de implantação.

VANTAGENS DE CULTURA EXTENSADA A BLASTOCÍSTICA

É importante ter um método de rastreio embrionário que permita transferir o número mínimo de embriões sem afectar a hipótese de gravidez. O desenvolvimento dos meios pelos quais os embriões crescem por períodos mais longos, até à fase blastocitária, permite seleccionar os melhores embriões a transferir. Assim, aumentou as taxas de implantação e reduziu as gestações múltiplas. Uma meta-análise, que avaliou 18 estudos controlados aleatórios, relatou que existe uma diferença significativa nas taxas de gravidez e partos em nascimento vivo para transferências no dia 5 em comparação com transferências no dia 3 (Blake et al., 2007).

A ideia de que são necessários meios sequenciais para um desenvolvimento embrionário óptimo tem um apelo intuitivo, mas não é apoiada por provas experimentais directas (Biggers et al., 2005). Em tais sistemas de cultura de meios sequenciais, o meio utilizado para cultura de embriões do 1º ao 3º dia de desenvolvimento difere na composição e/ou concentração de componentes do meio utilizado para cultura subsequente desde o 3º dia até à fase blastocisto (Gardner & Lane, 1997, 1998). Demonstrámos que o desenvolvimento in-vitro até ao estádio de blastocisto e subsequentes taxas de implantação são melhores para embriões humanos cultivados num único meio do que para aqueles cultivados num sistema sequencial de meios (Sepúlveda et al., 2009). A fertilização não ocorre ao mesmo tempo em todos os ovos, pelo que a época de implantação de cada embrião é diferente. Portanto, um único meio seria melhor, onde o embrião utiliza o que necessita.

Existem várias vantagens para a cultura até à fase blastocisto. Como discutido anteriormente, a cultura a longo prazo permite-nos distinguir os embriões viáveis com maior potencial de implantação daqueles que se desenvolveram inicialmente mas morrem mais tarde. Permite também avaliar a activação genómica do embrião (Braude et al., 1988), procurando os embriões que não atingem a fase de 8 células. As provas mostram que existe uma taxa mais baixa de aborto precoce quando os blastocistos são transferidos (Papanikolaou et al.., 2006).

In vivo, os embriões em fase de clivagem estão geralmente nas trompas de falópio, não no útero, razão pela qual a sincronização da transferência de embriões na fase de blastocisto com o ambiente uterino é mais fisiológica (Gardner et al., 1996). Outra vantagem da cultura a longo prazo é o tempo prolongado, que permite a transferência quando os blastómeros são removidos no dia 3 para diagnóstico genético pré-implantação.

O objectivo deste estudo foi rever a experiência e os resultados dos ciclos de reprodução assistida com embriões no quinto dia de desenvolvimento, comparando vários parâmetros de acordo com a idade do paciente.

MATERIAIS E MÉTODOS

Estudámos retrospectivamente 1.874 ciclos de reprodução assistida onde os embriões foram cultivados até ao quinto ou sexto dia de desenvolvimento, incluindo procedimentos de doação de oócitos (DO, n = 1.192; 2004 – 2010), fertilização in vitro (FIV) e injecção intracitoplasmática de esperma (ICSI) (n = 682, 2008-2010).

As seguintes taxas foram comparadas de acordo com a idade da paciente: formação de blastocistos, gravidez, implantação e aborto.

Inseminação/injecção

Para a inseminação em FIV convencional, cerca de 100.000 espermatozóides foram co-cultivados com complexos cúmulo-corona-oócitos. Para ICSI, apenas os oócitos da metafase II (MII) foram injectados, utilizando procedimentos descritos anteriormente (Sepúlveda et al., 2009).

Cultura de embriões

Oócitos fertilizados (2PN) foram cultivados individualmente em gotas de 10 |UL Global® media (Global Life, Canadá) suplementados com 10% de soro sintético substituto (SSS). No terceiro dia, os embriões foram mudados para o meio fresco Global®. A cultura foi feita sob óleo mineral a 37ºC numa atmosfera de 6,5% de CO2, 5% de O2 e 88,5% de N2. Foram realizadas avaliações do desenvolvimento embrionário sob os procedimentos descritos (Sepúlveda et al., 2009).

Transferência de embriões

Transferências de embriões foram realizadas no dia 5 ou 6 da cultura de embriões, utilizando um cateter Frydman Ultrasoft (Laboratórios CCD, França). Um ou dois embriões foram seleccionados para transferência. Se houvesse mais embriões disponíveis, estes eram congelados ou vitrificados.

Definição dos parâmetros analisados

A taxa de formação de blastocistos é o número total de blastocistos entre o total de 2PN oócitos. A taxa de gravidez foi definida como o número de ciclos com pelo menos um saco gestacional entre o número de ciclos transferidos. A taxa de aborto foi definida como o número de gravidezes com perda total de sacos gestacionais antes das 20 semanas de gestação, entre o número de gravidezes. A taxa de implantação foi calculada com base no número de sacos gestacionais entre o número total de embriões transferidos.

Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico STATA 10.0 (StataCorp LP, 4905 Lakeway Drive, College Station, TX, EUA). A normalidade da distribuição das variáveis contínuas foi avaliada com um teste Kolmogorov-Smirnov. As variáveis contínuas foram avaliadas com estatística paramétrica (teste t de Student) ou estatística não paramétrica (teste Mann-Whitney Rank Sum). Para variáveis não contínuas, foi utilizado o teste do qui-quadrado ou o teste exacto de Fisher. As diferenças foram consideradas significativas com um p-valor de <0.05.

RESULTA E DISCUSSÃO

No programa de doação de oócitos, as culturas de blastocistos começaram em 2004 com 4% dos ciclos. Actualmente, a cultura alargada até à fase blastocisto tornou-se uma técnica de rotina, ocorrendo 90% dos casos em 2010 (Figura 2).

Quadro 1 descreve os 4 grupos que foram comparados. Pacientes com menos de 35 anos de idade, pacientes entre 34 e 39 anos de idade, pacientes com mais de 39 anos e pacientes que receberam oócitos de jovens doadores (DO). O número de oócitos obtidos por aspiração folicular, como esperado, diminuiu com a idade. A proporção de ciclos em que a ICSI foi utilizada como método de inseminação foi semelhante em todos os grupos (Tabela 1).

O número de embriões que atingiram a fase blastocisto foi semelhante nos três grupos de pacientes com tendência a diminuir de acordo com a idade. Contudo, quando o oócito pertencia a um doador (DO), a taxa de formação de blastocistos aumentou mais de 40% (p< 0,05). A taxa foi de 40% entre os pacientes mais jovens apenas 34% entre os pacientes mais velhos (Quadro 2). Em contraste com os nossos resultados, Thomas et al. (2010) relataram que a idade dos pacientes com idade foi negativamente associada à formação de blastocistos. Do mesmo modo, a percentagem de embriões criopreservados é mais elevada entre o grupo de DO e pacientes com menos de 35 anos do que entre pacientes com mais de 35 anos (Quadro 2).

A percentagem de ciclos com transferências canceladas foi de cerca de 15% entre pacientes com mais de 34 anos de idade (Figura 3). Os cancelamentos poderiam dever-se ao baixo número de oócitos obtidos durante a recolha de óvulos, o que leva a menos ou nenhum embrião disponível, em comparação com a recolha com mulheres mais jovens. Contudo, alguns relatórios mostraram que a transferência de blastocistos pode ser aplicável a qualquer paciente sem comprometer a probabilidade de transferência de embriões ou gravidez (Marek et al., 1999; Wilson et al.., 2002).

>

A taxa de gravidez variou de acordo com a idade da paciente: 48.4% para mulheres com menos de 35 anos e 38,6% para mulheres com mais de 39 anos (Figura 4). Quando foram feitos ciclos com oócitos doados por mulheres jovens, a taxa de gravidez aumentou para 58,1%, um valor maior do que em todos os grupos de pacientes (p <0,005).

Neste estudo, o número máximo de embriões transferidos foi de dois, o que tem sido a nossa política desde 2004, a fim de evitar o risco de gravidez múltipla. A elevada taxa de implantação mostrada em todos os grupos reflecte o maior potencial de implantação de embriões transferidos no quinto dia (Figura 4), também mostrado por outros estudos (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). No entanto, a taxa de implantação é mais baixa nos pacientes em comparação com o grupo de DO. Isto pode ser explicado por factores adicionais relacionados com a causa da infertilidade em pacientes (Marino et al., 2011), uma vez que as dadoras de ovos são mulheres jovens sem problemas reprodutivos aparentes. Além disso, há provas de alterações graves no desenvolvimento endometrial em ciclos estimulados (Haouzi et al., 2010). Isto pode ser benéfico para as receptoras do grupo de DO porque não foram estimuladas.

P>Embora a taxa de gravidez das pacientes mais velhas seja elevada com transferência de blastocisto, a taxa de aborto é de 59,1%, o que é significativamente mais elevada do que as taxas dos outros grupos (Figura 5).

Este estudo, tal como outros, mostrou um declínio na fertilidade para as mulheres com mais de 35 anos (Van Noord-Zaadstra et al.., 1991; Perheentupa & Huhtaniemi, 2099), que é significativamente inferior ao declínio entre as mulheres com mais de 40 anos (Marcus & Brinsden, 1996). Por outro lado, a menor probabilidade de conseguir uma gravidez bem sucedida relacionada com o aumento da idade materna é caracterizada por uma maior prevalência de anomalias cromossómicas no oócito que levam a uma redução significativa nas taxas de implantação (Munné, 2002) e altas taxas de aborto espontâneo (Munné et al., 1995; Nybo-Andersen et al.., 2000).

>/p>

CONCLUSÕES

Cultura embrionária prolongada até à fase de blastocisto pode ser implementada num programa de reprodução assistida a fim de aumentar a probabilidade de gravidez em pacientes, porque a selecção natural pode ocorrer durante a cultura embrionária.

O potencial de implantação de blastocistos é elevado, permitindo-nos transferir menos embriões e reduzir a probabilidade de gravidezes múltiplas. A cultura de blastocistos é uma alternativa que permite escolher um embrião a transferir em mulheres jovens.

A taxa de cancelamento é maior entre pacientes com mais de 35 anos de idade, talvez devido à diminuição da reserva ovárica e ao menor número de oócitos obtidos, dado que os embriões atingem a fase de blastocisto independentemente da idade da paciente.

BARCROFT LC, OFFENBERG H, THOMSEN P, WATSON AJ (2003) Aquaporin proteins in murine trophectoderm mediate trans-epithelial water movements during cavitation. Dev Biol 256: 342-354.

BIGGERS JD, MCGINNIS LK, LAWITTS JA (2005) Um passo versus dois passos de cultura de embriões pré-implantação de ratos: existe diferença? Hum Reprod 20: 3376-3384.

BLAKE DA, FARQUHAR CM, JOHNSON N, PROCTOR M (2007) Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception. Cochrane Database Syst Rev 4: CD002118.

BRAUDE P, BOLTON V, MOORE S (1988) A expressão do gene humano ocorre primeiro entre os estádios de quatro e oito células do desenvolvimento pré-implantatório. Natureza 332: 459-461.

GARDNER DK, LANE M (1997) Culture and selection of viable blastocysts: a feasible proposition for human IVF? Hum Reprod Update 3: 367-382.

GARDNER DK, LANE M (1998) Cultura de blastocistos humanos viáveis em meios sequenciais definidos sem soro. Hum Reprod 3: 148-159.

GARDNER DK, LANE M, CALDERON I, LEETON J (1996) Ambiente do embrião humano pré-implantado in vivo: análise metabólica dos fluidos oviduto e uterino e metabolismo das células cúmulos. Fertil Steril 65: 349-353.

GARDNER DK, SCHOOLCRAFT WB, WAGLEY L, SCHLENKER T, STEVENS J, HESLA J (1998) Um ensaio prospectivo randomizado de cultura de blastocistos e transferência em fertilização in-vitro. Hum Reprod 13: 3434-3440.

HAOUZI D, ASSOU S, DECHANET C, ANAHORY T, DECHAUD H, DE VOS J, HAMAMAH S (2010) Hiperestimulação ovárica controlada para fertilização in vitro altera a receptividade endometrial em humanos: efeitos protocolares. Biol Reprod. 82:679-686.

MAREK D, LANGLEY M, GARDNER DK, CONFER N, DOODY KM, DOODY KJ (1999) Introdução da cultura de blastocistos e transferência para todos os pacientes num programa de fertilização in vitro. Fertil Steril 72: 1035-1040.

MARCUS SF, BRINSDEN PR (1996) Fertilização in-vitro e transferência de embriões em mulheres com 40 anos de idade ou mais. Hum Reprod Update 2: 459468.

MARINO JL, MOORE VM, RUMBOLD AR, DAVIES MJ (2011) Tratamentos de fertilidade e as mulheres jovens que os utilizam: um estudo de coorte australiano. Hum Reprod 26: 473-479.

MUNNÉ S (2002) Diagnóstico genético pré-implantação de anomalias cromossómicas numéricas e estruturais. Reprod Biomed Online 4: 183196.

MUNNÉ S, ALIKANI M, TOMKIN G, GRIFO J, COHEN J (1995) A morfologia do embrião, as taxas de desenvolvimento e a idade materna estão correlacionadas com as anomalias cromossómicas. Fertil Esteril 64: 382-391.

NYBO ANDERSEN AM, WOHLFAHRT J, CHRISTENS P, OLSEN J, MELBYE M (2000) Maternal age and fetal loss: population-based register linkage study. BMJ 320: 1708-1712.

PAPANIKOLAOU EG, CAMUS M, FATEMI HM, TOURNAYE H, VERHEYEN G, VAN STEIRTEGHEM A, DEVROEY P (2006) A perda precoce de gravidez é significativamente mais elevada após o terceiro dia de transferência de embriões única que após o quinto dia de transferência de blastocistos única em ciclos de FIV estimulados pelo antagonista de GnRH. Reprod Biomed Online 12: 60-65.

PERHEENTUPA A, HUHTANIEMI I (2009) Envelhecimento do ovário e testículo humano. Mol Cell Endocrinol 299: 2-13.

SEPÚLVEDA S (2008) Fecundación y desarrollo en humanos In: LERNER J & URBINA MT (eds) Reproducción Asistida. Caracas: Editorial Médica Panamericana. pp: 119-123.

SEPÚLVEDA S, GARCÍA J, ARRIAGA E, DÍAZ J, NORIEGA-PORTELLA L, NORIEGA-HOCES L. (2009) Desenvolvimento in vitro e resultados de gravidez para embriões humanos cultivados num único meio ou num sistema sequencial de meios de comunicação. Fertil Esteril 91:1765-1770.

THOMAS MR, SPARKS AE, RYAN GL, VAN VOORHIS BJ (2010) Clinical predictors of human blastocyst formation and pregnancy after extended embryo culture and transfer. Fertil Steril 94: 543-548.

VAN NOORD-ZAADSTRA BM, LOOMAN CW, ALSBACH H, HABBEMA JD, TE VELDE ER, KARBAAT J (1991) Atraso da gravidez: efeito da idade sobre a fecundidade e resultado da gravidez. BMJ 302:1361-1365.

WILSON M, HARTKE K, KIEHL M, RODGERS J, BRABEC C, LYLES R (2002) Integração da transferência de blastocistos para todos os pacientes. Fertil Steril 77: 693-696.