Como desenhar um primer

Desenho de primers para PCR

Prímeros de oligonucleótidos são necessários ao executar uma reacção PCR. É necessário desenhar primers que sejam complementares à região do modelo de ADN. Eles são sintetizados quimicamente através da união de nucleótidos. Deve-se bloquear e desbloquear selectivamente repetidamente os grupos reactivos num nucleótido quando se adiciona um nucleótido de cada vez. A principal propriedade dos primários é que devem corresponder a sequências na molécula modelo (deve ser complementar ao cordão do modelo). No entanto, os iniciadores não precisam de corresponder completamente à cadeia do modelo; é essencial, contudo, que a extremidade de 3′ do iniciador corresponda completamente à cadeia de ADN do modelo para que o alongamento possa prosseguir. Normalmente utiliza-se uma guanina ou citosina na extremidade de 3′, e a extremidade de 5′ do iniciador tem normalmente estiramentos de vários nucleótidos. Além disso, ambas as extremidades de 3′ dos iniciadores hibridizados devem apontar uma para a outra.

O tamanho do primer é também muito importante. Os iniciadores curtos são utilizados principalmente para amplificar um pequeno e simples fragmento de ADN. Por outro lado, um primer longo é utilizado para amplificar uma amostra de ADN genómico eucariótico. Contudo, um primer não deve ser demasiado longo (> primers de 30-mer) ou demasiado curto. Primários curtos produzem um produto de amplificação de ADN impreciso e inespecífico, e primários longos resultam numa taxa de hibridação mais lenta. Em média, o fragmento de ADN que precisa de ser amplificado deve ter um tamanho entre 1-10 kB.

A estrutura do primário deve ser relativamente simples e não deve conter nenhuma estrutura secundária interna para evitar a dobra interna. Também é necessário evitar o recozimento do primer-primer, que cria dímeros de primer e perturba o processo de amplificação. Ao conceber, se não se tiver a certeza sobre o nucleótido a colocar numa determinada posição dentro do primário, pode-se incluir mais do que um nucleótido nessa posição denominado um local misto. Também se pode utilizar uma inserção molecular baseada em nucleótidos (inosina) em vez de um nucleótido regular para capacidades de emparelhamento mais amplas.

Tendo em consideração a informação acima, os primários devem geralmente ter as seguintes propriedades:

• Comprimento de 18-24 bases
• 40-60% de conteúdo G/C
• Início e fim com 1-2 pares G/C
• Temperatura de fusão (Tm) de 50-60°C
• Pares de Primários devem ter um Tm dentro de 5°C um do outro

• Pares de Primários não devem ter regiões complementares

  Nota: Se incluir um local de restrição no final de 5′ do seu primário, note que deve ser adicionado um “clamp” de 3-6 pares de bases a montante para que a enzima se parta eficientemente (e.g. GCGGCG-site de restrição – a sua sequência).