Microscope optique- définition, principe, types, parties, grossissement

Dernière mise à jour le 26 janvier 2021 par Sagar Aryal

Histoire de la microscopie : Aperçu

• L’évolution du domaine de la microbiologie a mis en perspective le besoin d’identifier, de voir, d’observer et de comprendre les micro-organismes, y compris leurs morphologies structurelles et leurs mécanismes. La portée de la microbiologie est d’étudier les organismes et les agents minuscules qui ne peuvent être examinés et observés qu’avec un microscope.
• Bien que scientifiquement, le premier microscope simple a été découvert par deux scientifiques hollandais, Zaccharias Janssen et son père, Hans qui fabriquait des lunettes, ont été les premiers à expérimenter avec leurs lentilles en combinant des lentilles dans un tube et ont observé que les objets qui étaient à proximité, semblaient plus proches et plus grands. Bien qu’il ne soit pas inclus comme une découverte scientifique, cet acte a ouvert la voie à l’évolution scientifique.
• Dans l’histoire de la microbiologie, Antony Van Lewnehoueek un microbiologiste amateur a fabriqué le premier microscope simple, qui lui a permis d’observer la présence de minuscules organismes vivants dans l’eau d’un étang qui apparaissaient comme des points. Son microscope simple était composé d’une double lentille de verre convexe qui était maintenue entre deux plaques d’argent.
• L’application de la microscopie en microbiologie a amélioré la visualisation des cellules et des micro-organismes en agrandissant leurs images pour les rendre plus grandes.

Le microscope à lumière est également connu sous le nom de microscope optique.

Qu’est-ce qu’un microscope optique?

• Un microscope optique est un instrument ou un outil de laboratoire de biologie, qui utilise la lumière visible pour détecter et agrandir de très petits objets, et les agrandir.
• Ils utilisent des lentilles pour focaliser la lumière sur le spécimen, l’agrandissant ainsi produisant une image. Le spécimen est normalement placé à proximité de la lentille microscopique.
• Le grossissement microscopique varie considérablement en fonction des types et du nombre de lentilles qui composent le microscope. En fonction du nombre de lentilles, il existe deux types de microscopes : le microscope à lumière simple (il a un faible grossissement car il utilise une seule lentille) et le microscope à lumière composée (il a un grossissement plus élevé par rapport au microscope simple car il utilise au moins deux jeux de lentilles, un objectif et un oculaire). Les lentilles sont alignées en ce sens que, elles peuvent être capables de courber la lumière pour un grossissement efficace de l’image.
• Le fonctionnement du microscope optique repose sur sa capacité à focaliser un faisceau de lumière à travers un spécimen, très petit et transparent, pour produire une image. L’image est ensuite passée à travers une ou deux lentilles afin d’être agrandie pour être visualisée. La transparence du spécimen permet une pénétration facile et rapide de la lumière. Les spécimens peuvent varier des bactéries aux cellules et autres particules microbiennes.

Figure : Schéma des microscopes optiques, créé avec biorender.com

Principe d’un microscope optique)

Comme mentionné précédemment, les microscopes optiques visualisent une image en utilisant une lentille de verre et le grossissement est déterminé par, la capacité de la lentille à courber la lumière et à la focaliser sur le spécimen, ce qui forme une image. Lorsqu’un rayon de lumière passe d’un milieu à un autre, le rayon se courbe à l’interface, ce qui provoque une réfraction. La courbure de la lumière est déterminée par l’indice de réfraction, qui est une mesure de l’importance du ralentissement de la vitesse de la lumière par une substance. La direction et l’ampleur de la courbure de la lumière sont déterminées par les indices de réfraction des deux milieux qui forment l’interface.

Un milieu avec un indice de réfraction plus faible comme le verre vers l’air, il accélère normalement la pénétration de la lumière et fait courber la lumière loin de la normale et lorsque la lumière traverse un milieu avec un indice de réfraction plus important comme l’air vers le verre, elle ralentit normalement et se courbe vers la normale, perpendiculairement à la surface.

Si l’on met un objet entre ces deux milieux c’est-à-dire entre l’eau et l’air, dans ce cas, un prisme, le prisme va courber la lumière selon un angle. C’est ainsi que les lentilles microscopiques fonctionnent, elles courbent la lumière à un angle. La lentille (convexe), lorsqu’elle reçoit les rayons lumineux, les concentre en un point spécifique appelé point focal (point F). La mesure de la distance entre le centre de la lentille et le point focal est connue sous le nom de longueur focale.

Un microscope utilise des lentilles dont la force est prédéterminée, en ce sens que, la force d’une lentille est directement liée à la longueur focale c’est-à-dire qu’une courte longueur focale grossit davantage les objets que les lentilles avec une longue longueur focale.

La microscopie fonctionne strictement avec un facteur de résolution moyennant quoi la résolution est la capacité d’une lentille à pouvoir différencier les petits objets qui sont étroitement serrés les uns contre les autres. La résolution d’un microscope optique est déterminée par une ouverture numérique de son système de lentilles et par la longueur d’onde de la lumière qu’il emploie ; une ouverture numérique une définition des longueurs d’onde de la lumière produite lorsque le spécimen est éclairé.

Une distance minimale (d) entre deux objets qui permet de les distinguer comme étant deux entités distinctes, déterminée par les longueurs d’onde de la lumière peut être calculée par une équation d’Abbe en utilisant la longueur d’onde de la lumière qui a illuminé le spécimen (Lambda, λ) et l’ouverture numérique (NA, n sin Ɵ) c’est-à-dire.Soit d=0,5 λ/n sin Ɵ

Types de microscopes optiques (microscope optique)

Avec l’évolution du domaine de la microbiologie, les microscopes

utilisés pour visualiser les spécimens sont à la fois des microscopes optiques simples et composés, utilisant tous des lentilles. La différence est que les microscopes optiques simples utilisent une seule lentille pour le grossissement, tandis que les lentilles composées utilisent deux lentilles ou plus pour le grossissement. Cela signifie, qu’une série de lentilles sont placées dans un ordre tel que, une lentille grossit l’image plus loin que la lentille initiale.

Les types modernes de microscopes lumineux comprennent :

1. Microscope optique à champ clair
2. Microscope optique à contraste de phase
3. Microscope optique à champ sombre

.Microscope optique à champ clair

4. Microscope optique à fluorescence

Microscope optique à champ clair (microscope à lumière composée)

• C’est le Microscope optique le plus basique utilisé dans les laboratoires de microbiologie qui produit une image sombre sur un fond clair. Composé de deux lentilles, il est largement utilisé pour visualiser les organites des cellules végétales et animales, y compris certains parasites comme la paramécie après coloration avec des colorants de base.
• Sa fonctionnalité repose sur le fait de pouvoir fournir une image à haute résolution, ce qui dépend fortement de la bonne utilisation du microscope. Cela signifie qu’une quantité adéquate de lumière permettra une focalisation suffisante de l’image, pour produire une image de qualité.
• Il est également connu sous le nom de microscope à lumière composée.

Parties d’un microscope à champ clair (Microscope à lumière composée)

Figure créée avec biorender.com

Il est composé de :

• Deux lentilles qui comprennent l’objectif et l’oculaire ou lentille oculaire.
• L’objectif est composé de six verres ou plus, qui rendent l’image claire de l’objet
• Le condenseur est monté sous la platine qui focalise un faisceau de lumière sur le spécimen. Il peut être fixe ou mobile, pour ajuster la qualité de la lumière, mais cela dépend entièrement du microscope.
• Ils sont maintenus ensemble par un dos courbe métallique robuste utilisé comme bras et un support au fond, appelé base, du microscope. Le bras et la base maintiennent toutes les parties du microscope.
• La platine où l’échantillon est placé, permettant le mouvement de l’échantillon autour pour une meilleure visualisation avec les boutons flexibles et c’est là où la lumière est focalisée.
• Deux boutons de focalisation i.e le bouton de réglage fin et le bouton de réglage grossier, trouvés sur le bras des microscopes, qui peuvent déplacer la platine ou la pièce de nez pour se concentrer sur l’image. l’affinement de la clarté de l’image.
• Il a un illuminateur de lumière ou un miroir trouvé à la base ou sur les microbes de la pièce de nez.
• La pièce de nez a environ trois à cinq lentilles d’objectif avec différents pouvoirs de grossissement. Il peut se déplacer autour de n’importe quelle position en fonction de la lentille de l’objectif pour se concentrer sur l’image.
• Un diaphragme d’ouverture est également connu comme le contraste, qui contrôle le diamètre du faisceau de lumière qui passe à travers le condenseur, en ce que, lorsque le condenseur est presque fermé, la lumière vient à travers au centre du condenseur créant un contraste élevé. Mais lorsque le condenseur est largement ouvert, l’image est très lumineuse avec un contraste très faible.

Magnification par microscope à champ clair (microscope à lumière composée)

Lors de la visualisation, l’objectif reste parfocal ce qui signifie que lorsque l’objectif est changé, l’image reste toujours au point. L’objectif joue un rôle majeur dans la mise au point de l’image sur le condenseur formant une image claire agrandie dans le microscope, qui est ensuite encore agrandie par l’oculaire pour obtenir une image primaire.

Ce qui est vu dans le microscope comme une image claire agrandie du spécimen est connu comme l’image virtuelle. Pour calculer le grossissement, il faut multiplier ensemble le grossissement de l’objectif et celui de l’oculaire. Le grossissement est standard, c’est-à-dire qu’il n’est ni trop élevé ni trop faible, et par conséquent, selon le pouvoir de grossissement des lentilles, il sera compris entre 40X et 100oX.

Calcul du grossissement = Grossissement de la lentille de l’objectif/magnification de la lentille de l’oculaire

La lentille de l’objectif joue un rôle essentiel non seulement pour agrandir l’image mais aussi pour la rendre claire pour la vision, une caractéristique connue sous le nom de résolution. La résolution selon Prescott, est la capacité d’un objectif à séparer ou à distinguer de petits objets étroitement liés entre eux.

Alors que l’oculaire agrandit l’image à la fin de la visualisation, sa plage de grossissement est inférieure à celle de l’objectif à 8X-12X (10X standard) et à celle de l’objectif à 40X-100X, le grossissement, et la résolution du microscope dépendent fortement de l’objectif.

Applications du microscope à lumière à champ clair (microscope à lumière composée)

Très utilisé en microbiologie, ce microscope permet de visualiser des spécimens fixes et vivants, qui ont été colorés avec des colorants de base. Cela donne un contraste pour une visibilité facile sous le microscope. Il peut donc être utilisé pour identifier les cellules bactériennes de base et les protozoaires parasites tels que la paramécie.

Fiche de travail gratuite sur le microscope à lumière

Clé de réponse

Microscope à contraste de phase

• C’est un type de microscope optique dans lequel de petites déviations lumineuses connues sous le nom de déphasages se produisent pendant la pénétration de la lumière dans l’échantillon non coloré. Ces déphasages sont convertis en image pour signifier que, lorsque la lumière traverse l’échantillon opaque, les déphasages éclaircissent l’échantillon en formant une image éclairée (lumineuse) en arrière-plan.
• Le microscope à contraste de phase produit des images à haut contraste lorsqu’on utilise un échantillon transparent plus particulièrement celles des cultures microbiennes, des fragments de tissus minces, des tissus cellulaires et des particules subcellulaires.
• Le principe de fonctionnement du microscope à contraste de phase est l’utilisation d’une méthode optique pour transformer un spécimen en une image d’amplitude, qui est visualisée par l’oculaire du microscope.
• Le PCM peut être utilisé pour visualiser des cellules non colorées également connues comme les objets de phase, ce qui signifie que la morphologie de la cellule est maintenue et que les cellules peuvent être observées dans leur état naturel, avec un contraste élevé et une clarté efficace. Ceci est dû au fait que si les spécimens sont colorés et fixés, ils tuent la plupart des cellules, une caractéristique qui est uniquement annulée par le microscope à fond clair.
• Les décalages qui se produisent pendant la pénétration de la lumière, deviennent convertis en changements d’amplitude qui causent le contraste de l’image.
• Couplés avec des éléments augmentant le contraste tels que la fluorescence, ils produisent de meilleurs visuels de l’image des spécimens.

Parties du microscope à contraste de phase

L’instrumentation du microscope à contraste de phase est basée sur ses voies de lumière depuis la réception de la source de lumière jusqu’à la visualisation de l’image.

Par conséquent, son séquentiel est constitué de :

• Source lumineuse (lampe à arc au mercure)
• Lentille collective
• Ouverture
• Condenseur
• Condenseur annulaire
• Spécimen
• Objectif
• Plaque de phase
• Lumière réfléchie

.

• Bague de phase

Le fonctionnement du microscope à contraste de phase

• Le changement causé par la lumière diffusée déviée (Défléchie) et la lumière non déviée qui atteint le spécimen qui est absorbé, crée à une certaine longueur d’onde, produisant la couleur. La différence créée par la lumière diffusée et celle de la lumière absorbée est connue sous le nom de variations d’amplitude. Ces variations d’amplitude sont sensibles à permettre la visualisation par un équipement photographique comme le microscope à contraste de phase, donc vu par l’œil humain.
• Le condenseur du microscope à contraste de phase a un disque opaque qui est connu comme un anneau annulaire, avec un anneau transparent qui produit un cône de lumière, qui passe à travers un spécimen. En raison des variations de la lumière, une partie de la lumière se courbe au niveau de l’échantillon, en raison des variations de la densité de la lumière, formant une image au niveau de l’objectif. La lumière non déviée va frapper l’anneau de phase sur la plaque de phase et la lumière déviée va manquer l’anneau de phase en passant directement par la plaque de phase, cela forme une image.

Le microscope à contraste de phase est conçu avec des lentilles d’objectif qui ont la capacité de remplir plusieurs fonctions lorsqu’elles sont combinées avec des techniques d’amélioration du contraste, par exemple, la fluorescence. Les lentilles d’objectif sont situées dans la plaque de phase interne avec une variation de l’absorption de la lumière et du déplacement de phase, c’est-à-dire une non-diffraction, créant un large spectre pour contraster le spécimen et former un fort contraste dans le fond.

Applications du microscope à contraste de phase

• Déterminer les morphologies des cellules vivantes comme les cellules végétales et animales
• Etudier la motilité microbienne et les structures de locomotion
• Détecter certains éléments microbiens comme les endospores bactériennes

Microscope à lumière rasante.Field Light Microscope

C’est un type spécialisé de microscope à lumière à champ clair qui présente plusieurs similitudes avec le microscope à contraste de phase. Pour fabriquer un microscope à fond noir, il faut placer un diaphragme à fond noir en dessous et une lentille condensatrice qui produit un faisceau de lumière en cône creux qui entre dans l’objectif uniquement, à partir de l’échantillon (Prescott, pg 22).

Cette technique est utilisée pour visualiser des cellules vivantes non colorées. Ceci est effectué par la façon dont l’illumination est faite sur le spécimen en ce sens que, lorsqu’un faisceau de lumière en cône creux est transmis au spécimen, les rayons lumineux déviés (non réfléchis/non réfractés) ne traversent pas les objectifs mais la lumière non déviée (réfléchie/réfractée) traverse les objectifs jusqu’au spécimen en formant une image.

Ceci fait que le champ environnant du spécimen apparaît noir alors que le spécimen apparaîtra illuminé. Ceci est permis par le fond sombre d’où le nom, microscopie à champ sombre.

Applications du microscope à champ sombre

• Il est utilisé pour visualiser les organes internes de cellules plus grandes comme les cellules eucaryotes
• Identification de cellules bactériennes avec des formes distinctives comme Treponema pallidum, un agent causal de la syphilis.

Le microscope fluorescent

Les microscopes discutés ci-dessus produisent normalement des images après qu’une lumière ait été transmise et ait traversé le spécimen.

Dans le cas du microscope fluorescent, le spécimen émet de la lumière. Comment ? En ajoutant une molécule de colorant au spécimen. Cette molécule de colorant devient normalement excitée lorsqu’elle absorbe de l’énergie lumineuse, donc elle libère toute énergie piégée sous forme de lumière. L’énergie lumineuse libérée par la molécule excitée a une grande longueur d’onde par rapport à sa lumière rayonnante. La molécule de colorant est normalement un fluorochrome, qui devient fluorescent lorsqu’il est exposé à la lumière d’une certaine longueur d’onde spécifique. L’image formée est une image marquée par le fluorochrome à partir de la lumière émise

Le principe de ce mécanisme de fonctionnement est que le microscope fluorescent va exposer le spécimen à une lumière ultra ou violette ou bleue, ce qui forme une image du spécimen qui est émanée par la lumière fluorescente. Ils disposent d’une lampe à arc à vapeur de mercure qui produit un faisceau lumineux intense qui passe à travers un filtre excitateur. Le filtre excitateur fonctionne pour transmettre une longueur d’onde spécifique au spécimen coloré par un fluorochrome, produisant l’image marquée par un fluorochrome, au niveau de l’objectif.

Après l’objectif, il y a un filtre barrière qui fonctionne principalement pour éliminer tout rayonnement ultraviolet qui pourrait être nocif pour la lumière de l’observateur, réduisant ainsi le contraste de l’image.

Figure créée avec biorender.com

Applications du microscope à lumière fluorescente

• Utilisé dans la visualisation d’agents bactériens tels que Mycobacterium tuberculosis.
• Utilisé pour identifier les anticorps spécifiques produits contre les antigènes/pathogènes bactériens dans les techniques d’immunofluorescence en marquant les anticorps avec des fluorochromes.
• Utilisé dans les études écologiques pour identifier et observer les micro-organismes marqués par les fluorochromes
• Il peut également être utilisé pour différencier les bactéries mortes et vivantes par la couleur qu’elles émettent lorsqu’elles sont traitées avec des colorants spéciaux

En dehors des microscopes discutés ci-dessus, il existe un microscope peu utilisé connu sous le nom de microscopie à contraste d’interférence différentielle. Il est très similaire au microscope à contraste de phase par lequel les images sont formées à partir des variations de la lumière soit déviée et soit non déviée. La différence est qu’ici, deux faisceaux de lumière sont émis vers le spécimen et focalisés par un prisme. L’un des faisceaux traverse le prisme pour atteindre l’échantillon, tandis que l’autre traverse la zone transparente de la lame de verre sans l’échantillon. Les deux faisceaux se combinent alors et interfèrent l’un avec l’autre pour former une image. Il peut être utilisé pour visualiser les structures cellulaires telles que les endospores, les parois cellulaires bactériennes, les noyaux et les granules pour les spécimens non colorés.

1. Microbiologie par Laning M. Prescott, 5th Edition
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• <https://answersdrive.com/what-is-a-microscope-and-how-does-it-work-6865065
• <http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/microscopy.html
• <http://www.brainkart.com/article/The-compound-light-microscope_20126/
• <http://web.utk.edu/~prack/MSE%20300/Lightmicroscopyhandout.pdf