DNA origami asta per filamenti spessi ingegnerizzati
DNA origami aste sono stati progettati utilizzando caDNAno software43 (Figura 1 supplementare). Per piegare il DNA origami asta, 50 nM di scaffold (p8064, tilibit nanosystems) è stato miscelato con 500 nM graffe nucleo. Oligonucleotidi sono stati ottenuti da Hokkaido System Science o IDT. La reazione di piegatura è stata effettuata in tampone piegatura (5 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA e 18 mM MgCl2) con riscaldamento rapido a 80 ° C e raffreddamento in singoli gradi passi a 60 ° C oltre 2 h seguita da un ulteriore raffreddamento in singoli gradi passi a 25 ° C per altri 72 h. Un elenco completo di tutte le sequenze oligonucleotidi può essere trovato in dati supplementari 2.
I bastoncini di DNA origami piegati sono stati purificati da ultracentrifugazione gradiente di glicerolo secondo Lin et al.44. Brevemente, 15-45% (v / v) soluzioni di glicerolo gradiente in 1 × TE buffer contenente 18 mM MgCl2 sono stati fatti, e le frazioni di glicerolo contenente monomerici DNA origami aste sono stati determinati da elettroforesi gel di agarosio. La concentrazione dei bastoncini di DNA origami è stata determinata da uno spettrofotometro Nanodrop (Thermo Scientific), e la soluzione è stata aliquotata e conservata a -80 ° C fino all’uso.
Costruisci il design
Per il sottoframmento-1 (S1) del costrutto della miosina, la miosina IIa cDNA del muscolo scheletrico umano (Kazusa Product ID FXC25901) è stato troncato a Ala849. Questo frammento includeva il dominio motore, il dominio di legame delle catene leggere essenziali (ELC) e il dominio di legame delle catene leggere regolatorie (RLC). Per l’etichettatura oligonucleotidica e la purificazione della proteina, SNAP-tag (New England Biolabs Inc.), FLAG-tag e 6 × His-tag sono stati attaccati al C-terminale. Due aminoacidi (Leu-Glu) corrispondenti al sito di riconoscimento dell’endonucleasi di restrizione (XhoI: CTCGAG) sono stati tenuti tra SNAP-tag e FLAG-tag. Per il costrutto nullo della catena leggera (S1 senza braccio di leva), i siti di legame ELC e RLC (Lys786-Leu846) sono stati eliminati dal costrutto S1. Questi frammenti di miosina sono stati introdotti a valle del sito di clonazione multi del vettore pShuttle-CMV (Agilent Technologies). Per il dominio di legame all’actina del costrutto α-actinina, α-actinina umana 1 cDNA (Addgene; pEGFP-N1 alfa-actin1) è stato troncato al dominio di legame all’actina (Asp1-Ala247). Per l’etichettatura dell’oligonucleotide e la purificazione della proteina, SNAP-tag e 6 × His-tag sono stati attaccati al C-terminale tramite linkers (3 a.a., GGL). Questo frammento α-actinin1-SNAP-His è stato introdotto a valle del promotore T7 del plasmide pET T7-7 (Addgene).
Espressione della proteina e purificazione
Miosina umana IIa S1 e S1 senza braccio: gli adenovirus ricombinanti sono stati prodotti utilizzando il sistema di vettori adenovirali AdEasy XL (Agilent Technologies). Gli adenovirus prodotti sono stati purificati utilizzando l’AdEasy Virus Purification Kit (Agilent Technologies). Ricombinante espressione miosina e purificazione sono stati eseguiti secondo un precedente studio 31. Brevemente, murino C2C12 mioblasti (RIKEN Cell Bank) sono stati coltivati in DMEM (alto glucosio, Nacalai tesque) integrato con 10% FBS (Gibco) e 1% Penicillina / Streptomicina (Nacalai tesque). Per indurre la differenziazione in miotubi, le cellule sono state coltivate fino alla confluenza, e il mezzo è stato sostituito con DMEM integrato con 2% di siero di cavallo (Gibco) e 1% di penicillina / treptomicina. Quarantotto ore dopo la differenziazione, le cellule sono state infettate con 1 × 106-8 unità formanti placche di virus. Quarantotto ore dopo l’infezione, il mezzo è stato commutato nuovamente in mezzo di crescita. Dopo 3-5 giorni di scambio di mezzo, le cellule sono state lavate con PBS e raccolte mediante raschiamento delle cellule. Le cellule sono state poi lisate con un omogeneizzatore dounce e centrifugate. La miosina ricombinante è stata purificata dal lisato chiarificato usando il sistema AKTA purify come segue (GE Healthcare). In primo luogo, la miosina è stata purificata mediante purificazione di affinità His-tag con una colonna di nichel-sefarosio HisTrap HP da 1 ml (GE Healthcare). La soluzione eluita miosina è stato poi dializzato durante la notte a 4 ° C in un basso contenuto di sale (25 mM imidazolo pH 7.0, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT). Infine, la miosina ricombinante è stato purificato su un 1 ml HiTrap Q HP sepharose anion-exchange column (GE) utilizzando un 0-1 M gradiente lineare NaCl.
Per preparare il dominio di legame actina di α-actinina, in primo luogo, il plasmide pET T7-7 contenente la sequenza α-actinina è stato trasformato in E.coli ceppo Rosetta (DE3). Il terreno LB con 100 μg mL-1 di ampicillina è stato inoculato con cellule Rosetta precoltivate e poi incubate a 37 °C. La sovraespressione di α-actinina è stata indotta dall’aggiunta di isopropil β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM quando OD600 raggiunto 0,6-0,8. Le cellule sono state coltivate per una notte a 16 °C. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione (50.000 × g a 4 °C per 30 min), risospese in 25 mM di tampone fosfato di sodio pH 7.6, 150 mM NaCl, 10 mM β-Me, e inibitore di proteine (PI) (Thermo:Halt™ Protease Inhibitor Cocktail, senza EDTA (100 × )) e conservate a -20 °C. Le cellule congelate sono state scongelate e poi lisate mediante sonicazione. Triton X-100 e polietileneimina sono stati aggiunti a concentrazioni finali di 1% e 0,05%, rispettivamente. Dopo 30 min sul ghiaccio, i detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione a 50.000 × g, 4 ° C per 30 min Imidazolo è stato aggiunto al surnatante chiarificato per dare una concentrazione finale di 10 mM. TALON Metal Affinity Resins (Clontech) equilibrato con tampone normale (25 mM tampone fosfato di sodio (pH 7,6), 150 mM NaCl, 10 mM β-Me) sono stati aggiunti alla soluzione estratta proteina α-actinina e incubato per 30 min a 4 ° C per legarli a tag istidina. Le proteine non specifiche legate sono state rimosse con il tampone di lavaggio (tampone normale contenente 10 mM imidazolo e PI). Le proteine α-actinina sono stati eluiti con tampone di eluizione (tampone normale contenente 100 mM imidazolo e PI).
Oligonucleotide etichettatura
Oligonucleotide reazioni di etichettatura per la miosina II sono stati eseguiti subito dopo la purificazione a scambio anionico. Ammina-modificato oligonucleotidi DNA (NH2/GTGATGTAGGTGGTAGAGGAA) (Hokkaido System Science) sono stati collegati al substrato SNAP, benzilguanina (BG; NEB), e 15-25 micron di BG-oligonuculeotidi sono stati etichettati con ~ 1 micron di miosina II contenente un C-terminale SNAP-tag (NEB) in anion-exchange elution buffer per 30 minuti a temperatura ambiente. Oligonucleotide-etichettato miosina II è stato purificato per affinità filamento di actina, aliquoted e conservati a -80 ° C fino all’uso. L’efficienza di etichettare gli oligonucleotidi alla miosina II è stata stimata da un gel-shift test (4-15% gel gradiente, Biorad) e determinato come >99% sia per S1 e leva braccio senza S1 (Supplementary Fig. 2).
Oligonucleotide-etichettatura reazioni per α-actinina sono state effettuate subito dopo l’His-tag purificazione di affinità. SNAP substrato, BG-modificato DNA oligonucleotidi (TGGATATGGTGGAGAGGAG/BG) sono stati preparati come descritto nella preparazione miosina sopra, e 15-25 μM di BG-oligonuculeotidi sono stati etichettati con ~ 1 μM α-actinina contenente un C-terminale SNAP-tag nel His-tag affinità tampone di eluizione per 30 min a temperatura ambiente. Oligonucleotide-etichettato α-actinina è stato purificato da una colonna a scambio anionico (HiTrapQ HP), aliquoted e conservati a -80 ° C fino all’uso. L’efficienza di etichettare gli oligonucleotidi per α-actinina è stato stimato da un gel-shift test (4-15% gel gradiente, Biorad) e determinato come >95%.
DNA-GNP coniugazione
GNP di quaranta nanometri (British BioCell International) sono stati risospesi e incubati durante la notte in 2,5 mM Bis (p-solfonatofenil)fenilfosfina diidrato dipotassio (BSPP) soluzione (Sigma-Aldrich) mentre agitando delicatamente per stabilizzare il GNPs ad alte concentrazioni di particelle45. Per eseguire la coniugazione rapida, abbiamo seguito un protocollo di coniugazione assistita da pH46,47 come segue. 0,15 nM GNPs sono stati concentrati 15 volte mediante centrifugazione a 5000 × g per 10 min 400 μM oligonucleotide tiolato (corrispondente a ‘tiolo/TTTTTTTTTTTTTTTTTTT’) è stato trattato con 100 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP, Sigma-Aldrich) e purificato utilizzando cromatografia ad esclusione di dimensione (Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad). La purificazione della colonna è stata eseguita tre volte. 4.800 volte eccesso oligonucleotide è stato aggiunto al concentrato GNPs. Tampone citrato-HCl (pH = 3) è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 10 mM. Dopo 10 minuti di incubazione, 1 M Hepes buffer (pH = 7) è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 100 mM. Il DNA coniugato GNPs sono stati conservati a 4 ° C.
DNA origami asta-miosina-GNP coniugazione
Prima di osservazione, il DNA coniugato GNPs sono stati separati da una quantità in eccesso di oligonucleotide da 100 kDa MWCO filtri (Amicon Ultra, MERCK) con tampone TE aggiunto al filtro. La filtrazione è stata eseguita quattro volte. Il DNA coniugato GNPs sono stati infine risospesi in tampone TE con 11 mM MgCl2 in modo che la concentrazione finale di GNP è diventato ~ 1 nM. Purificato DNA-GNPs, DNA origami aste, domini di legame actina di α-actinina e miosine sono stati miscelati in un rapporto molare di ~ 1:1:80:50 e incubato almeno per 1 h.
Preparazione campione per GNP imaging
GNP esperimenti di imaging sono stati eseguiti all’interno di una camera di flusso assemblato con un diclorodimetilsilano (DDS)- vetro rivestito48 come segue. Coverslips sono stati puliti da plasma a bassa pressione per 3 min con un sistema al plasma (Zepto, Diener electronic, Germania). Dopo il risciacquo con acetone, i coprioggetti sono stati immersi in acetone per 20 min con sonicazione poi in etanolo per altri 20 min con sonicazione. Dopo il risciacquo con Milli-Q, i coprioggetti sono stati sonicati in 1 M KOH per 1 ora. Dopo aver sonicato in acetone ed etanolo di nuovo, i coprioggetti sono stati sonicati in 5 M KOH per 1 ora. Dopo il risciacquo con esano, i coprioggetti sono stati posti in esano con 0,1% DDS per 1,5 ore con agitazione delicata. Dopo il risciacquo con esano, i coprioggetti sono stati sonicati in esano per 1 min, asciugato da un soffiatore d’aria, e conservati a -30 ° C in condizioni di asciutto. La camera di flusso è stato assemblato da sandwich due pezzi di nastro biadesivo tra un non trattato coprioggetto e un coprioggetto rivestito DDS.
Per preparare un campione di osservazione, dopo aver lavato la camera con tampone saggio (5 mM HEPES-NaOH pH 7,8, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 500 μM EGTA), 0,2 mg ml-1 biotinilato BSA (ThermoFisher) è stato aggiunto alla camera e incubato per 3 min Dopo il lavaggio con tampone saggio, 0.2% Tween-20 (Sigma-Aldrich) è stato aggiunto alla camera, che è stato poi incubato per 10 min 0,2 mg ml-1 NeutraAvidina (ThermoFisher) soluzione, 5 μg ml-1 20% biotinilato filamento di actina, e ~ 100 pM DNA origami rod-miosina-GNP sono stati aggiunti alla camera in serie mentre il lavaggio della camera con tampone di dosaggio. La camera è stata poi incubata per 3 min Imaging buffer (0,11 mg ml-1 glucosio ossidasi, 18 μg ml-1 catalasi, 2,3 mg ml-1 glucosio, e 0,5% 2-mercaptoetanolo in tampone di saggio) tra cui ATP è stato fatto scorrere nella camera, che è stato poi sigillato con smalto e osservato al microscopio a 27 ± 1 ° C. Le traiettorie sono state analizzate utilizzando nonparametrico inferenza bayesiana (Fig. 6a) sui dati di esperimenti effettuati a 19 ± 0,5 ° C. Negli esperimenti ATP fluorescente, Cy3-marcato 2′/3′-O-(2-aminoetil-carbamoil)-adenosina-5′-trifosfato (Jena Bioscience) è stato aggiunto al buffer di imaging invece di ATP.
Obiettivo di tipo evanescente microscopia in campo scuro campo
GNP imaging è stato eseguito con un sistema MicroMirror TIRF (Mad City Labs)37,49. Uno schema del setup ottico è mostrato nella Fig. 3 supplementare. L’illuminazione è stata fornita da un laser 532 nm (2 W di potenza nominale, Coherent Genesis CX) e focalizzata sul piano focale posteriore dell’obiettivo (Olympus, ×60, NA = 1,49, olio) da una lente 250 mm di lunghezza focale attraverso un micromirror. Il laser di ritorno è stato diretto in un fotodiodo quadrante e utilizzato in un sistema di messa a fuoco automatica (TIRF Lock, Mad City Labs). La densità di potenza misurata al campione era ~ 2,5 kW cm-2 al massimo negli esperimenti. Considerando che un aumento della temperatura causa l’assorbimento della luce da parte di GNP50, abbiamo concluso che l’effetto di riscaldamento è trascurabile. Le immagini di diffusione e fluorescenza sono state separate da uno specchio dicroico (FF562-Di02-25 × 36) e acquisite da telecamere CMOS a 25.000 fps, 123 nm per pixel e 384 × 256 pixel per fotogramma (FASTCAM mini AX100, Photoron), e a 200 fps, 160 nm per pixel e 1024 × 512 pixel per fotogramma (ORCA-Flash4.0, Hamamatsu photonics). Un filtro di emissione (FF01-593/40-25) è stato posizionato sul percorso fluorescente. L’immagine fluorescente è stata utilizzata per osservare l’ATP fluorescente (Fig. 5). Per misurare i tempi di attesa ATP (Supplementary Fig. 6a, b), le immagini sono state acquisite a 1000 fps da AX100.
Imaging analisi dei dati
Le immagini GNP sono stati rapidamente localizzati per simmetria radiale basato sul metodo di localizzazione delle particelle51 (il software è disponibile nel riferimento) e schermato per escludere GNP che ha mostrato un comportamento imprevedibile dalla geometria del complesso (Supplementary Fig. 5). Abbiamo considerato la PNL esclusa per legare in modo non specifico alla superficie del vetro o non saldamente legare al complesso DNA origami asta-miosina-actina. Dopo lo screening, il GNPs sono stati localizzati da Gaussian distribuzione fitting20, e la traiettoria nella direzione dell’asse maggiore è stato analizzato da un metodo di inferenza utilizzando un modello di Markov nascosto39 assumendo due stati (stati vincolanti e staccato). Abbiamo stimato lo spostamento causato dal processo di generazione di actomiosina dalla distanza dedotta tra i due stati (Fig. 4d).
Per valutare gli stati nascosti nello stato distaccato, abbiamo usato l’inferenza bayesiana non parametrica basata su un modello di Markov nascosto41, che è in grado di rilevare gli stati molecolari nascosti senza definire il numero di stati in anticipo. Abbiamo scaricato e utilizzato file Matlab, in particolare “iHmmNormalSampleBeam.m”, con le seguenti ipotesi. In primo luogo, una traiettoria in ogni stato era normalmente distribuita. In secondo luogo, abbiamo assunto uno stato distaccato e infiniti stati vincolanti, e che gli stati vincolanti condividano la stessa distribuzione di emissione. Le deviazioni standard delle due distribuzioni di emissione dello stato distaccato e degli stati vincolanti sono state fissate a 12,5 nm e 4,7 nm, rispettivamente. I valori fissi sono stati ottenuti calcolando le deviazioni standard di tutti i punti e i punti degli stati di forte legame nelle traiettorie analizzate. I dati utilizzati per l’inferenza comprendevano 10.000 punti (400 ms). La probabilità di una transizione da uno stato vincolante a un altro stato vincolante è stata fissata a 0. Gli stati inferiti i cui punti erano <1% delle traiettorie analizzate o avevano tempi di permanenza <40 μs sono stati esclusi dall’analisi. Infine, le posizioni degli stati di legame dedotti sono state definite come le posizioni relative dalla posizione di distacco dedotta. Abbiamo eseguito l’inferenza 1000 volte, in cui l’iterazione dell’algoritmo Markov chain Monte Carlo è stato impostato su 1000 (Fig. 6a). Tra gli stati dedotti, gli stati le cui posizioni erano entro i picchi ± 1 SD sono stati utilizzati per calcolare l’accessibilità e il tempo di permanenza in Fig. 7a. Per testare l’accuratezza del rilevamento, abbiamo prodotto dati simulati assumendo 4 o 8 stati di legame transitori e uno stato distaccato con le deviazioni standard (12,5 nm e 4,7 nm) ottenuti dai dati sperimentali come descritto sopra.
Il corso del tempo dell’intensità di fluorescenza da Cy3-EDA-ATP è stato analizzato per calcolare il tempo di attesa ATP. Brevemente, il corso del tempo è stato acquisito facendo la media dell’intensità di una regione di interesse (ROI) di 7 × 7 pixel in ogni fotogramma. Il centro della ROI è stato definito dall’immagine di diffusione della PNL attaccata a una miosina. Una correzione del rumore di fondo è stata eseguita calcolando l’intensità media del perimetro intorno al ROI52. Abbiamo misurato il tempo di accensione adattando i dati ad un doppio decadimento esponenziale e definito il tasso più lento come il tasso di legame ATP, dando così un ciclo completo ATPase53. Il tasso di legame ATP di Cy3-EDA-ATP è stato corretto al tasso di ATP normale da un fattore di 2,854.
Preparazione di bilayer lipidici supportati da mica
Le vescicole lipidiche sono state preparate da uno stock cloroformio di composti lipidici mescolandoli in un tubo di vetro. Una composizione lipidica tipica era 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane (DPTAP) in un rapporto di peso di 0,98:0,02. In alcuni casi, il contenuto del lipide a carica positiva DPTAP è stato aumentato fino al 10%. Il cloroformio è stato fatto evaporare in un essiccatore sotto vuoto per almeno 30 minuti I lipidi sono stati sospesi in acqua Milli-Q (concentrazione totale di lipidi 1 mg/ml). La sospensione lipidica è stata vortexata e sonicata per produrre vescicole lipidiche multilamellari.
Bilayer lipidici supportati (SLBs) sono stati preparati da vescicole lipidiche tramite il metodo vescicola-fusione55. Le vescicole lipidiche sono state diluite a 0,25 mg ml-1 aggiungendo una soluzione di 10 mM MgCl2. La soluzione di vescicole è stato sonicato per ottenere piccole vescicole unilamellari. Gli SLB sono stati formati depositando 2 µl di soluzione di vescicole su mica appena scollata su un palco di vetro (diametro, 1,5 mm) e incubando per 10 minuti a 60 °C. Per evitare l’essiccazione del campione, il campione è stato incubato in un contenitore sigillato, al cui interno è stato inserito un pezzo di Kimwipe bagnato con acqua Milli-Q.
Preparazione del campione per l’imaging AFM
Bacchette di DNA (10 nM) e miosina-oligonucleotidi (1 µM) sono stati incubati per 30 min a 4 °C per formare coniugati miosina-DNA in anticipo. Dopo il risciacquo del substrato del bilayer lipidico con acqua Milli-Q e tampone A (10 mM HEPES-NaOH (pH 7,8), 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM EGTA) per rimuovere le vescicole non assorbite, una goccia (2 µl) di coniugati asta miosina-DNA in tampone A è stato depositato sui bilayer lipidici per 5 min in una cappa umida. Dopo il risciacquo con il buffer A, una goccia (2 µl) di filamenti di actina (1 µM) nel buffer A è stata depositata sui bilayer lipidici per 10 minuti in una cappa umida. Dopo il risciacquo con una soluzione contenente NPE-caged ATP (adenosina 5′-trifosfato, P3-(1-(2-nitrofenil) etil) estere) (Invitrogen) (0-1 µM) in buffer A, il campione è stato attaccato allo stadio di scansione di un apparecchio HS-AFM e immerso nella stessa soluzione (120 µl).
Immagini AFM ad alta velocità
Le immagini AFM sono state eseguite utilizzando un sistema HS-AFM (NanoExplorer, RIBM, Tsukuba, Giappone) con un cantilever in nitruro di silicio (frequenza di risonanza, 1,5 MHz in aria, costante di molla, 0,1 N m-1; Olympus BL-AC10DS-A2). Miosina-DNA coniugati asta e filamenti di actina sono stati debolmente adsorbiti lateralmente sulla superficie del substrato contenente DPTAP. Per ottenere immagini ad alta risoluzione di coniugati asta miosina-DNA in presenza di ATP, l’area di scansione è stata ristretta (in genere a circa 300 × 150 nm2), e il numero di pixel è stato ottimizzato (100 × 50 pixel). L’ATP ingabbiato è stato fotolizzato utilizzando una sorgente luminosa a lampada al mercurio (U-RFL-T, Olympus) e un filtro band-path (FF01-360/23-25, Semrock) durante l’osservazione per 30 s in media. La velocità media di scorrimento dei filamenti di actina negli esperimenti AFM a 1 µM di ATP ingabbiato era di 1,4 nm s-1. A giudicare dalla velocità di scorrimento dell’actina nel nostro test di motilità in vitro, la concentrazione finale di ATP negli esperimenti AFM è stata stimata a circa 190 nM. Le immagini AFM sono state analizzate utilizzando Eagle Software (RIBM, Tsukuba, Giappone) e ImageJ. Tutte le osservazioni sono state eseguite a temperatura ambiente.
Abbiamo applicato ad ogni immagine AFM un filtro gaussiano per rimuovere i rumori di punta e un filtro di appiattimento per rimuovere l’effetto substrato-inclinazione. Ogni posizione del dominio motore della miosina è stata determinata calcolando il centro di massa per misurare lo spostamento.
Statistiche e riproducibilità
Per gli esperimenti di imaging ad alta velocità e gli esperimenti AFM, abbiamo eseguito gli esperimenti almeno tre volte indipendentemente per ottenere i risultati coerenti. Le dimensioni dei passi di S1 senza leva e wild-type sono state analizzate statisticamente con test t a due code di studenti. Il numero di esperimenti indipendenti, il nome del test statistico, la dimensione dell’effetto e p-valori esatti sono forniti in ogni leggenda figura. La dimensione dell’effetto (g di Hedges) è stato calcolato dal codice MATLAB scaricato dal riferimento56. Abbiamo considerato un p-value < 0,05 una differenza significativa tra i mezzi. La gamma di p-valori sono indicati da asterischi nei grafici come *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Reporting summary
Ulteriori informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.
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