Obiettivi:

1. Per studiare le diverse fasi della crescita batterica.
2. Per tracciare la curva di crescita standard di Staphylococcus aureus.
3. Determinare il tempo di generazione di un dato batterio.

L’aumento della dimensione e della massa cellulare durante lo sviluppo di un organismo è definito crescita. È la caratteristica unica di tutti gli organismi. L’organismo deve richiedere alcuni parametri di base per la generazione di energia e la biosintesi cellulare. La crescita dell’organismo è influenzata da fattori fisici e nutrizionali. I fattori fisici includono il pH, la temperatura, la pressione osmotica, la pressione idrostatica e il contenuto di umidità del mezzo in cui l’organismo sta crescendo. I fattori nutrizionali includono la quantità di carbonio, azoto, zolfo, fosforo e altri oligoelementi forniti nel mezzo di crescita. I batteri sono organismi unicellulari (monocellulari). Quando i batteri raggiungono una certa dimensione, si dividono per fissione binaria, in cui una cellula si divide in due, due in quattro e continuano il processo in modo geometrico. Il batterio è allora noto per essere in una fase di crescita attiva. Per studiare la popolazione di crescita batterica, le cellule vitali del batterio devono essere inoculate in un brodo sterile e incubate in condizioni di crescita ottimali. Il batterio inizia a utilizzare i componenti del mezzo e aumenterà le sue dimensioni e la sua massa cellulare. La dinamica della crescita batterica può essere studiata tracciando la crescita cellulare (assorbanza) contro il tempo di incubazione o il log del numero di cellule contro il tempo. La curva così ottenuta è una curva sigmoidale ed è nota come curva di crescita standard. L’aumento della massa cellulare dell’organismo viene misurato utilizzando lo spettrofotometro. Lo spettrofotometro misura la torbidità o densità ottica che è la misura della quantità di luce assorbita da una sospensione batterica. Il grado di torbidità nel brodo di coltura è direttamente correlato al numero di microrganismi presenti, sia cellule vitali che morte, ed è un metodo conveniente e rapido per misurare il tasso di crescita cellulare di un organismo. Quindi l’aumento della torbidità del brodo indica un aumento della massa cellulare microbica (Fig 1). La quantità di luce trasmessa attraverso il brodo torbido diminuisce con un successivo aumento del valore dell’assorbanza.

Fig 1: Lettura dell’assorbanza della sospensione batterica

La curva di crescita ha quattro fasi distinte (Fig 2)

1. Fase lag

Quando un microrganismo viene introdotto nel terreno fresco, impiega un po’ di tempo per adattarsi al nuovo ambiente. Questa fase è chiamata fase lag, in cui il metabolismo cellulare è accelerato, le cellule aumentano di dimensioni, ma i batteri non sono in grado di replicarsi e quindi non c’è aumento della massa cellulare. La lunghezza della fase lag dipende direttamente dalla condizione di crescita precedente dell’organismo. Quando il microrganismo che cresce in un mezzo ricco viene inoculato in un mezzo povero di nutrienti, l’organismo impiegherà più tempo per adattarsi al nuovo ambiente. L’organismo inizierà a sintetizzare le proteine, i coenzimi e le vitamine necessarie per la sua crescita e quindi ci sarà un successivo aumento della fase di ritardo. Allo stesso modo, quando un organismo proveniente da un ambiente povero di nutrienti viene aggiunto ad un ambiente ricco di nutrienti, l’organismo può adattarsi facilmente all’ambiente, può iniziare la divisione cellulare senza alcun ritardo, e quindi avrà meno fase di ritardo che può essere assente.

2. Fase esponenziale o logaritmica (log)

Durante questa fase, i microorganismi sono in uno stato di rapida crescita e divisione. La loro attività metabolica aumenta e l’organismo inizia la replicazione del DNA per fissione binaria ad un ritmo costante. Il mezzo di crescita è sfruttato al massimo, la coltura raggiunge il massimo tasso di crescita e il numero di batteri aumenta logaritmicamente (esponenzialmente) e infine la singola cellula si divide in due, che si replicano in quattro, otto, sedici, trentadue e così via (cioè 20, 21, 22, 23………2n, n è il numero di generazioni). Il tempo impiegato dai batteri per raddoppiare di numero durante un determinato periodo di tempo è noto come tempo di generazione. Il tempo di generazione tende a variare con diversi organismi. L’E.coli si divide ogni 20 minuti, quindi il suo tempo di generazione è di 20 minuti, e per lo Staphylococcus aureus è di 30 minuti.

3. Fase stazionaria

Man mano che la popolazione batterica continua a crescere, tutti i nutrienti nel mezzo di crescita vengono utilizzati dal microorganismo per la sua rapida moltiplicazione. Questo porta all’accumulo di materiali di scarto, metaboliti tossici e composti inibitori come gli antibiotici nel mezzo. Questo modifica le condizioni del mezzo come il pH e la temperatura, creando così un ambiente sfavorevole alla crescita batterica. Il tasso di riproduzione rallenta, le cellule che si dividono sono uguali al numero di cellule morte, e infine il batterio smette di dividersi completamente. Il numero di cellule non aumenta e quindi il tasso di crescita si stabilizza. Se una cellula presa dalla fase stazionaria viene introdotta in un terreno fresco, la cellula può facilmente passare alla fase esponenziale ed è in grado di svolgere le sue attività metaboliche come al solito.

4. Fase di declino o di morte

L’esaurimento delle sostanze nutritive e il successivo accumulo di prodotti di scarto del metabolismo e di altri materiali tossici nei media faciliterà il batterio a passare alla fase di morte. Durante questa, il batterio perde completamente la sua capacità di riprodursi. I singoli batteri cominciano a morire a causa delle condizioni sfavorevoli e la morte è rapida e uniforme. Il numero di cellule morte supera il numero di cellule vive. Alcuni organismi che possono resistere a questa condizione possono sopravvivere nell’ambiente producendo endospore.

Fig 2: Diverse fasi di crescita di un batterio

CALCO:

Il tempo di generazione può essere calcolato dalla curva di crescita (Fig 3).

Fig 3: Calcolo del tempo di generazione

Sono stati presi i punti esattamente raddoppiati dalle letture di assorbanza e, i punti sono stati estrapolati per incontrare il rispettivo asse temporale.

Tempo di generazione = (Tempo in minuti per ottenere l’assorbanza 0.4) – (Tempo in minuti per ottenere l’assorbanza 0.2)

= 90-60

= 30 minuti

Lasciare No = il numero iniziale della popolazione

Nt = popolazione al tempo t

N = il numero di generazioni nel tempo t

Quindi,

,

Il tasso di crescita può essere espresso in termini di costante di crescita media (k), il numero di generazioni per unità di tempo.

Tempo medio di generazione o tempo medio di raddoppio (g), è il tempo impiegato per raddoppiare le sue dimensioni.