Abstract
Obiettivi. Gli anticorpi anti-dsDNA sono un marker per il Lupus Eritematoso Sistemico (SLE) e il 70-98% dei pazienti risulta positivo. Abbiamo valutato le caratteristiche demografiche, cliniche, di laboratorio e terapeutiche di una coorte monocentrica di LES in base allo stato degli anti-dsDNA. Metodi. Abbiamo identificato tre gruppi: anti-dsDNA + (positività persistente); anti-dsDNA ± (positività iniziale e successiva negatività nel corso della malattia); anti-dsDNA – (negatività persistente). L’attività della malattia è stata valutata con l’European Consensus Lupus Activity Measurement (ECLAM). Risultati. Abbiamo valutato 393 pazienti (anti-dsDNA +: 62,3%; anti-dsDNA ±: 13,3%; anti-dsDNA -: 24,4%). Il coinvolgimento renale era significativamente più frequente negli anti-dsDNA + (30,2%), rispetto agli anti-dsDNA ± e anti-dsDNA – (21,1% e 18,7%, rispettivamente; ). La sierosite è risultata significativamente più frequente negli anti-dsDNA – (82,3%) rispetto agli anti-dsDNA + e anti-dsDNA ± (20,8% e 13,4%, rispettivamente; ). La riduzione dei livelli sierici di C4 è stata identificata significativamente più frequentemente negli anti-dsDNA + e anti-dsDNA ± (40,0% e 44,2%, rispettivamente) rispetto agli anti-dsDNA – (21,8%, ). Non abbiamo identificato differenze significative nei valori medi ECLAM prima e dopo la modifica dello stato di anti-dsDNA (). Conclusione. Lo stato anti-dsDNA influenza le caratteristiche cliniche e immunologiche dei pazienti con SLE. Tuttavia, non sembra influenzare l’attività della malattia.
1. Introduzione
Il Lupus Eritematoso Sistemico (LES) è una malattia autoimmune, caratterizzata dalla produzione di un’ampia gamma di autoanticorpi, risultanti dall’attivazione delle cellule B policlonali, dall’alterazione delle vie apoptotiche o dalla disregolazione della rete idiotipica.
Gli anticorpi anti DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) sono considerati un marcatore specifico del LES. Grazie all’alta frequenza (dal 70% al 98%), sensibilità e specificità (57,3% e 97,4%, rispettivamente), la presenza di questi autoanticorpi potrebbe essere praticamente diagnostica per il LES. Inoltre, la loro identificazione in altre condizioni patologiche e in soggetti sani è molto rara (meno dello 0,5%). Inoltre, l’identificazione degli anti-dsDNA in pazienti con LES diversi anni prima dell’insorgenza della malattia suggerisce il loro coinvolgimento verso una malattia clinicamente evidente. In particolare, questi autoanticorpi sono stati associati al coinvolgimento dei reni, come dimostrato dalla loro deposizione in diverse strutture renali in pazienti con LES con nefrite attiva, cioè glomeruli, spazi subendoteliali e subepiteliali, mesangio, membrana basale e tubuli. Inoltre, attraverso l’interazione con il recettore toll-like 9 (TLR 9), l’anti-dsDNA complessato con il DNA potrebbe determinare l’attivazione delle cellule dendritiche, con conseguente attivazione delle cellule B e T e il rilascio di citochine proinfiammatorie. I dati della letteratura dimostrano che l’aumento dei livelli sierici di anti-dsDNA potrebbe precedere la ricaduta della malattia, soprattutto in termini di esacerbazione della malattia renale.
Nonostante il ruolo centrale di questi anticorpi nella patogenesi della malattia, una percentuale di pazienti con LES, variabile dal 2 al 30%, risulta negativa per gli anti-dsDNA. Alla luce di queste considerazioni, il presente studio ha valutato le caratteristiche cliniche e di laboratorio e l’approccio terapeutico in un’ampia coorte monocentrica di LES, raggruppando i pazienti in base al loro stato di anti-dsDNA ed effettuando un confronto tra i diversi sottogruppi.
2. Pazienti e metodi
Abbiamo arruolato pazienti con LES indirizzati alla Clinica Lupus dell’Unità di Reumatologia, Sapienza Università di Roma (Sapienza Lupus Cohort). La diagnosi è stata effettuata secondo i criteri rivisti dell’American College of Rheumatology (ACR) del 1997.
I pazienti hanno fornito un consenso informato scritto al momento della prima visita. Il comitato etico locale del “Policlinico Umberto I”, Roma, Italia, ha approvato lo studio. Ad ogni visita, i pazienti sono stati sottoposti ad un esame fisico completo. I dati clinici e di laboratorio sono stati raccolti in un modulo standardizzato, computerizzato e compilato elettronicamente, inclusi i dati demografici, l’anamnesi con la data della diagnosi, le comorbilità e i trattamenti precedenti e concomitanti.
Abbiamo valutato l’attività della malattia utilizzando l’European Consensus Lupus Activity Measurement (ECLAM), poiché questo indice non include la misurazione degli anticorpi anti-dsDNA.
2.1. Valutazione clinica dei pazienti con SLE
Secondo i criteri rivisti dell’ACR del 1997, abbiamo registrato la presenza delle seguenti manifestazioni di SLE:(i)Coinvolgimento della pelle. Eruzione malare (eritema fisso, piatto o in rilievo, sulle eminenze malari, tendente a risparmiare le pieghe nasolabiali), eruzione discoide (chiazze eritematose in rilievo con desquamazione cheratotica aderente e tamponamento follicolare; nelle lesioni più vecchie può verificarsi una cicatrizzazione atrofica), e fotosensibilità (eruzione cutanea come risultato di una reazione insolita alla luce solare, dall’anamnesi del paziente o dall’osservazione del medico).(ii)Ulcere orali. Ulcerazione orale o nasofaringea osservata dal medico.(iii)Serosite. Pleurite (storia convincente di dolore pleuritico o sfregamento sentito da un medico o prova di versamento pleurico) o pericardite (documentata da elettrocardiogramma o sfregamento o prova di versamento pericardico).(iv)Coinvolgimento dei reni. Proteinuria persistente >0,5 grammi al giorno o > di 3+ se la quantificazione non viene eseguita o calchi cellulari (globuli rossi, emoglobina, granulare, tubulare o misto).(v)Disturbo neurologico. Convulsioni (in assenza di farmaci incriminanti o squilibri metabolici noti, ad esempio uremia, chetoacidosi o squilibrio elettrolitico) o psicosi (in assenza di farmaci incriminanti o squilibri metabolici noti, ad esempio uremia, chetoacidosi o squilibrio elettrolitico).(vi)Disturbo ematologico. Anemia emolitica con reticolocitosi o leucopenia <4.000/mm3 in ≥2 occasioni o linfopenia <1.500/mm3 in ≥2 occasioni o trombocitopenia <100.000/mm3 in assenza di farmaci offensivi.
Le manifestazioni cliniche erano cumulative e riferite all’anamnesi della malattia.
2.2. Valutazione di laboratorio
Il protocollo di studio prevedeva la determinazione degli autoanticorpi e la valutazione dei livelli sierici di C3 e C4. In particolare, gli ANA sono stati determinati mediante immunofluorescenza indiretta (IIF) su HEp-2 (titolo ≥1 : 160 o ++ su una scala da + a ++++), gli anti-dsDNA con IIF su Crithidia luciliae (titolo ≥1 : 10), ENA (compresi anti-Ro/SSA, anti-La/SSB, anti-Sm, e anti-RNP) con test ELISA considerando titoli superiori al cut-off del laboratorio di riferimento, anti-cardiolipina (anti-CL) (isotipo IgG/IgM) con ELISA, nel siero o plasma, a titoli medi o alti (es.g., >40 GPL o MPL o sopra il 99° percentile), anti-β2 Glicoproteina-I (anti-β2GPI) (isotipo IgG/IgM) mediante ELISA, nel siero (sopra il 99° percentile), e lupus anticoagulante (LA) secondo le linee guida della Società Internazionale di Trombosi ed Emostasi (sottocomitato scientifico sul lupus anticoagulante/anticorpi dipendenti dai fosfolipidi) . Infine, le concentrazioni sieriche di C3 e C4 sono state studiate mediante immunodiffusione radiale.
In base allo stato degli anti-dsDNA, abbiamo identificato tre gruppi di pazienti:(i)Anti-dsDNA +: pazienti con LES con positività persistente.(ii)Anti-dsDNA ±: pazienti di LES con positività iniziale e successiva negatività durante il decorso della malattia.(iii)Anti-dsDNA -: pazienti di LES con negatività persistente.
Abbiamo valutato tutti i pazienti all’ultima visita nella nostra Clinica del Lupus. Lo stato degli anticorpi è stato valutato durante tutto il decorso della malattia; di conseguenza, i follow-up dello stato degli anticorpi corrispondevano alla durata della malattia.
2.3. Valutazione statistica
Abbiamo usato la versione 13.0 del pacchetto statistico SPSS. Le variabili distribuite normalmente sono state riassunte usando la media ± la deviazione standard (SD) e le variabili distribuite in modo non normale erano la mediana e il range. Le percentuali sono state utilizzate quando appropriato. Il test di Mann-Whitney è stato eseguito di conseguenza. I confronti univariati tra le variabili nominali sono stati calcolati utilizzando il test del chi-quadro o il test di Fisher, quando appropriato. Sono stati riportati i valori a due code; i valori inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.
3. Risultati
Nel presente studio, abbiamo valutato 393 pazienti con LES. Duecentonovantasette pazienti (75,6%) hanno mostrato una positività persistente o precedente per gli anti-dsDNA. Raggruppando i pazienti in base allo stato degli anti-dsDNA, 245 pazienti (62,3%) erano anti-dsDNA +, 52 (13,3%) anti-dsDNA ±, e 96 (24,4%) anti-dsDNA -. Per quanto riguarda i soggetti anti-dsDNA ±, gli anticorpi anti-dsDNA sono diventati negativi dopo un periodo medio dalla diagnosi di anni.
Come riportato nella tabella 1, non sono state identificate differenze significative tra i tre gruppi di pazienti riguardo alla distribuzione del sesso, l’età media e la durata media della malattia.
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| a: anti-dsDNA + contro anti-dsDNA ±; b: anti-dsDNA ± contro anti-dsDNA -; c: anti-dsDNA + contro anti-dsDNA -. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Abbiamo valutato i dati relativi alla distribuzione delle caratteristiche cliniche (Figura 1), dei parametri di laboratorio (Figura 2) e delle terapie (Figura 3) nei tre gruppi di soggetti.
Il coinvolgimento renale era significativamente più frequente nei pazienti anti-dsDNA + (73 pazienti, 30,2%) rispetto agli anti-dsDNA ± (11 pazienti, 21,1%) e anti-dsDNA – (18 pazienti, 18,7%) (per entrambi i confronti, Figura 1). Al contrario, la sierosite è risultata significativamente più frequente negli anti-dsDNA – (79 pazienti, 82,3%) rispetto agli anti-dsDNA + e anti-dsDNA ± (51 (20,8%) e 7 pazienti (13,4%), rispettivamente; , Figura 1).
Per quanto riguarda le anomalie immunologiche (Figura 2), i diversi autoanticorpi hanno mostrato una distribuzione simile nei tre gruppi tranne gli anti-RNP che erano significativamente più frequenti nei gruppi anti-dsDNA + e anti-dsDNA ± , rispetto agli anti-dsDNA – . Allo stesso modo, la riduzione dei livelli sierici di C4 è risultata più frequente negli anti-dsDNA + e anti-dsDNA ± che negli anti-dsDNA – (21 (21,8%) pazienti; per entrambi i confronti, Figura 2).
Negli anti-dsDNA +, abbiamo eseguito un confronto tra i pazienti con e senza anticorpi anti-RNP: i pazienti con anti-RNP + hanno mostrato più spesso manifestazioni cutanee rispetto a quelli di anti-RNP negativi (70,0% contro 49,3%, ). Inoltre, la frequenza di anti-Sm era più alta nei pazienti con anti-RNP rispetto ai pazienti negativi (57,5% contro 4,6%, ).
Finalmente, un approccio terapeutico simile è stato applicato nei tre gruppi di pazienti, con una percentuale simile di farmaci immunosoppressori, ad eccezione della ciclosporina A che è stata prescritta più frequentemente nei pazienti anti-dsDNA + (60 pazienti, 24.5%) rispetto ai pazienti anti-dsDNA ± e anti-dsDNA – (9 (17,3%) e 12 (12,5%) pazienti, rispettivamente; Figura 3).
Inoltre, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli anti-dsDNA ± (pazienti con positività iniziale e successiva negatività nel corso della malattia). Al fine di valutare i cambiamenti dell’attività della malattia, abbiamo valutato i valori medi ECLAM prima (anni medi di follow-up) e dopo (anni medi di follow-up) la modifica anti-dsDNA. Non sono state identificate differenze significative nei valori ECLAM medi prima e dopo il ritorno a risultati negativi ( versus , ; Figura 4). Inoltre, il confronto dei valori ECLAM medi tra i pazienti anti-dsDNA ± e anti-dsDNA + non ha mostrato alcuna differenza significativa ( versus , ).
Questo risultato è stato confermato indirettamente dalla valutazione del trattamento in questo gruppo di pazienti: Il 46,1% dei pazienti ha mantenuto lo stesso trattamento indipendentemente dalla modifica anti-dsDNA. Tuttavia, il 17,3% della popolazione divenuta negativa agli anti-dsDNA ha richiesto l’introduzione di un nuovo trattamento immunosoppressore.
4. Discussione
I risultati del presente studio hanno identificato un’associazione tra la persistente o precedente positività agli anti-dsDNA e specifiche caratteristiche cliniche (coinvolgimento renale) e immunologiche (riduzione dei livelli sierici di C4, positività agli anticorpi anti-RNP). Al contrario, i pazienti negativi per gli anti-dsDNA sembrano mostrare un quadro clinico caratterizzato da una maggiore prevalenza di sierosite. Inoltre, i pazienti che sperimentano la modifica dello stato di anti-dsDNA durante il decorso della malattia non sembrano rappresentare un sottogruppo specifico.
Il LES è una malattia autoimmune, potenzialmente coinvolgente qualsiasi organo/sistema, con un decorso remittente-relapsing. Da un punto di vista patogenetico, la produzione di diversi autoanticorpi caratterizza la malattia. Tra questi, gli anti-dsDNA rappresentano il segno distintivo dei pazienti affetti da LES che hanno un valore diagnostico data la loro forte specificità. Inoltre, la presenza di anti-dsDNA è stata associata ad un quadro di malattia più grave caratterizzato da un coinvolgimento renale, e un aumento del titolo può predire una ricaduta della malattia.
Nonostante queste considerazioni sul ruolo degli anti-dsDNA, un crescente interesse è dedicato ad altri anticorpi rilevati nel siero dei pazienti con LES, come evidenziato dai criteri di classificazione recentemente proposti dalla Systemic Lupus International Collaborating Clinics. Infatti, questa nuova classificazione è caratterizzata dalla modifica delle voci immunologiche: gli autoanticorpi diversi dagli anti-dsDNA, come gli anti-Sm, LA, anti-CL, e anti-β2GPI, sono stati considerati come un unico criterio, determinando il maggior peso di questi anticorpi nella classificazione dei pazienti con LES.
D’altra parte, i dati della letteratura suggeriscono un’associazione tra diversi autoanticorpi e specifiche manifestazioni cliniche come anti-dsDNA e nefrite lupica, anti-SSA/SSB e sintomi sicca, e anti-RNP e fenomeno di Raynaud. To e Petri nel 2005 hanno identificato diversi cluster di autoanticorpi in una vasta coorte di pazienti con LES. Gli autori hanno suggerito che il cluster Sm/RNP rappresenta il sottogruppo più benigno, con un coinvolgimento cutaneo più frequente e manifestazioni renali ed ematologiche meno comuni. Al contrario, il cluster anti-dsDNA/LA/anti-CL è caratterizzato da manifestazioni neuropsichiatriche ed eventi trombotici.
Nella presente coorte, abbiamo registrato una frequenza di anti-dsDNA maggiore del 70% che è simile ai dati riportati in letteratura per altre popolazioni caucasiche di LES. Lo stato di positività persistente o precedente per gli anti-dsDNA sembra identificare un sottogruppo di LES caratterizzato dalla positività per gli anti-RNP e dalla riduzione dei livelli sierici di C4. Inoltre, la frequenza significativamente più alta di coinvolgimento renale nei pazienti persistentemente positivi è in accordo con i dati degli studi epidemiologici, confermando così il ruolo patogenetico degli anti-dsDNA nel danno renale. Inoltre, l’associazione con bassi livelli sierici di C4 conferma il legame tra anti-dsDNA e complemento nei pazienti con LES con manifestazioni renali. Evidenze recenti suggeriscono l’influenza dei recettori del complemento nello sviluppo di anti-dsDNA partecipando alla clearance degli immunocomplessi e/o modulando l’attivazione delle cellule B in risposta all’antigene.
L’associazione con una maggiore frequenza di anti-RNP potrebbe essere difficile da interpretare. Come è noto, i pazienti affetti da malattia mista del tessuto connettivo sono frequentemente positivi per questi autoanticorpi, con una frequenza che raggiunge il 100%. Nei pazienti affetti da LES, la presenza di anti-RNP varia dal 10 al 30% ed è associata a manifestazioni specifiche, come l’artrite e il fenomeno di Raynaud.
Inoltre, secondo i dati della suddetta analisi condotta da To e Petri, il cluster Sm/RNP sembra essere il sottogruppo più benigno, con un coinvolgimento renale meno comune. Nella nostra coorte, la presenza di coinvolgimento articolare e del fenomeno di Raynaud è simile nei tre gruppi di pazienti. Questi risultati potrebbero essere spiegati dalla diversa etnia nelle coorti valutate. Nella coorte precedente, meno del 60% dei pazienti di LES valutati erano caucasici; al contrario, quasi tutti i pazienti di LES valutati nella presente analisi sono caucasici.
Inoltre, abbiamo analizzato il gruppo di pazienti di LES persistentemente negativi per gli anti-dsDNA, identificando una frequenza significativamente più alta di sierosite rispetto ai pazienti positivi agli anti-dsDNA. I dati della letteratura descrivono la sierosite come una manifestazione frequente del LES, soprattutto come pericardite (8-48% dei pazienti) e pleurite (30-45%). Nella nostra analisi, la frequenza della sierosite nei pazienti persistentemente anti-dsDNA negativi è risultata superiore all’80%. Diversi autori hanno riportato l’associazione tra sierosite e positività per anticorpi anti-SSA/SSB, non confermata nella nostra coorte. Certamente, un limite da considerare è il numero relativamente piccolo di pazienti in questo gruppo (96 soggetti), determinando cautela nell’interpretazione dei risultati. Alla luce delle caratteristiche di questo gruppo, una migliore analisi, valutando una popolazione più ampia, potrebbe essere molto interessante per caratterizzare questi pazienti con LES e modificare qualche aspetto strettamente legato alla positività per gli anti-dsDNA. Per esempio, i farmaci biologici, come il belimumab, potrebbero essere prescritti esclusivamente nei pazienti con positività per l’anti-dsDNA, considerando la malattia attiva solo in questi pazienti.
Un diverso background genetico potrebbe spiegare queste differenze. Il LES è una malattia multifattoriale in cui fattori genetici e ambientali interagiscono, determinando lo sviluppo della malattia. Il background genetico potrebbe spiegare non solo la suscettibilità alla malattia ma anche la produzione di autoanticorpi. Lo studio di associazione genoma-wide, condotto da Chung e colleghi nel 2011, ha dimostrato che molti geni precedentemente identificati associati al LES sono più fortemente associati alla produzione di anti-dsDNA che alla suscettibilità alla malattia. Gli autori hanno dimostrato l’associazione tra polimorfismi (SNPs) situati nelle regioni MHC, STAT4, IRF5, e ITGAM e la positività per gli anticorpi anti-dsDNA. Al contrario, solo gli SNPs nelle regioni MHC e IRF5 sono stati identificati in pazienti negativi. Questi risultati hanno suggerito che alcune varianti genetiche potrebbero essere considerate “loci di propensione autoanticorpale” piuttosto che “loci di suscettibilità del LES” . Infine, per la prima volta il presente studio ha analizzato un gruppo particolare di pazienti con LES, quelli con positività iniziale e successiva negatività degli anti-dsDNA. Alcuni punti da considerare sono stati derivati dalla valutazione di questo gruppo. In primo luogo, l’unica differenza clinica e di laboratorio identificata nei pazienti che diventano negativi per gli anti-dsDNA rispetto ai pazienti persistentemente positivi è stata una minore frequenza di coinvolgimento renale. Inoltre, la modifica dello stato degli autoanticorpi non era associata a un cambiamento dell’attività della malattia, come dimostrato dall’assenza di differenze significative nei valori medi ECLAM prima e dopo il cambiamento di stato. Abbiamo scelto di valutare l’attività di malattia attraverso l’ECLAM, perché questo indice non include la determinazione degli anti-dsDNA tra gli elementi valutati, a differenza di altri indici di attività di malattia come il SLE Disease Activity (SLEDAI) . Questa osservazione è rafforzata dalla valutazione delle strategie terapeutiche adottate in questo gruppo di pazienti dopo le modifiche dello stato degli anti-dsDNA. Quasi la metà dei pazienti ha mantenuto lo stesso trattamento e il 17,3% ha richiesto l’introduzione di un nuovo farmaco immunosoppressore. L’insieme di questi risultati suggerisce che la presenza di anti-dsDNA è associata a un sottogruppo specifico di malattia con caratteristiche cliniche e di laboratorio peculiari, che non cambiano quando gli anti-dsDNA diventano negativi, mantenendo un aspetto simile anche in termini di attività della malattia. Al contrario, lo stato persistentemente negativo degli anti-dsDNA sembra identificare un altro sottogruppo di pazienti, con caratteristiche cliniche peculiari, in particolare la sierosite.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
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