Formazione di biofilm su dispositivi intrauterini in pazienti con candidosi vulvovaginale ricorrente

Abstract

Un biofilm è una comunità complessa di cellule associate alla superficie racchiusa in una matrice polimerica. Si attaccano alle superfici solide e la loro formazione può essere influenzata dalle condizioni di crescita e dalla coinfezione con altri patogeni. La presenza del biofilm può proteggere i microrganismi dalle difese dell’ospite, così come ridurre significativamente la loro suscettibilità agli agenti antifungini. I microbi patogeni possono formare biofilm sulle superfici inerti di dispositivi impiantati come cateteri, valvole cardiache protesiche e dispositivi intrauterini (IUD). Il presente studio è stato condotto per analizzare la presenza di biofilm sulla superficie dei dispositivi intrauterini in pazienti con candidosi vulvovaginale ricorrente, e per determinare il profilo di suscettibilità dei lieviti isolati all’amfotericina B e al fluconazolo. La Candida albicans è stata recuperata dagli IUD ed è risultata suscettibile agli agenti antifungini quando testata in condizioni di crescita planctonica. Questi risultati indicano la presenza del biofilm sulla superficie dello IUD come un importante fattore di rischio per la candidosi vulvovaginale ricorrente.

Introduzione

Il biofilm è una struttura complessa che può essere prodotta da vari microorganismi, compresi i membri del genere Candida. La sua produzione varia a seconda dell’ambiente e del substrato disponibile. I biofilm si attaccano alle superfici solide e la loro formazione può essere influenzata dalle condizioni di crescita e dalla coinfezione con altri microrganismi. La presenza di biofilm può servire come un serbatoio di microrganismi e può anche portare alla resistenza agli agenti antimicrobici. Sebbene i biofilm batterici siano stati studiati in dettaglio, ci sono stati pochi studi sui biofilm fungini legati alla medicina. I dispositivi intrauterini (IUD) sono il metodo più comunemente usato per prevenire la fecondazione. Il presente articolo descrive due casi di pazienti con segni e sintomi di candidosi vulvovaginale ricorrente (RVVC) che usavano gli IUD come metodo contraccettivo. Dopo la loro rimozione, l’IDU è stato analizzato per la presenza di biofilm sulle loro superfici, e il modello di suscettibilità dei lieviti recuperati dai dispositivi è stato studiato.

Materiali e metodi

Pazienti

Due pazienti con segni e sintomi suggestivi di RVVC, definiti da almeno quattro episodi sintomatici in 1 anno, sono stati arruolati nel presente studio dopo aver ottenuto l’approvazione dell’Institutional Review Board. Gli studi microbiologici sono stati condotti presso l’Ospedale dell’Università di San Paolo, San Paolo, Brasile.

Caso 1

La paziente aveva 29 anni, sposata, con due figli e presentava sintomi clinici suggestivi di RVVC (presenza di perdite vaginali, prurito vulvare, prurito ed eritema). È risultata negativa all’infezione da HIV e al diabete mellito. La paziente aveva usato lo IUD per tre anni e un mese come metodo contraccettivo e ha riferito che i sintomi erano iniziati subito dopo l’impianto del dispositivo. Questi sintomi si erano intensificati nel corso dell’ultimo anno, soprattutto in termini di prurito e perdite. La paziente ha menzionato che in diverse visite ginecologiche precedenti era stata trattata con fluconazolo. Durante l’attuale visita ginecologica, è stato raccolto un campione di secrezione dalla vagina della paziente con tamponi sterili dalle pareti laterali della vagina e dal fondo del sacco vaginale, con l’aiuto di uno speculum non lubrificato. Il materiale clinico è stato raccolto fresco per un esame immediato in 3 ml di soluzione salina sterile (NaCl 0,85%). Le secrezioni vaginali sono state preparate sulle superfici di due vetrini sterili per la colorazione di Gram. I tamponi vaginali sono stati inoculati direttamente su piastre Petri contenenti Sabouraud dextrose agar medium (Difco, Detroit, USA) e su piastre Petri contenenti CHROMagar Candida (Parigi, Francia) per facilitare l’isolamento di Candida spp. Tutte le colture sono state incubate per 10 giorni a 37°C. Lo IUD è stato rimosso dalla paziente dopo gli esami ginecologici e di laboratorio. La rimozione dello IUD è stata effettuata in condizioni antisettiche ed è stata eseguita senza che lo IUD toccasse la parete vaginale o lo strumento di apertura per evitare la contaminazione da parte della flora vaginale. Immediatamente dopo la rimozione dello IUD la paziente è stata trattata per via orale con una singola dose di 150 mg di fluconazolo. Tre mesi dopo la rimozione dello IUD la paziente tornò per una seconda visita ginecologica dove non presentava segni o sintomi suggestivi di RVVC e gli esami di laboratorio delle secrezioni vaginali erano negativi per i lieviti.

Caso 2

La paziente aveva 38 anni, era sposata e presentava sintomi clinici suggestivi di RVVC (presenza di perdite vaginali con un aspetto grumoso, cottage-cheese, prurito vulvare e prurito). Anche lei è risultata negativa all’HIV e al diabete mellito. La paziente ha riferito che le perdite e il prurito erano peggiorati negli ultimi due anni. Aveva usato uno IUD per circa cinque anni come metodo contraccettivo. La paziente ha menzionato che nelle precedenti visite ginecologiche era stata trattata con fluconazolo. Durante l’esame ginecologico, le secrezioni vaginali sono state raccolte con tamponi sterili con l’aiuto di uno speculum non lubrificato. Il materiale clinico è stato raccolto fresco per un esame immediato in 3 ml di soluzione salina sterile (NaCl 0,85%). Le secrezioni vaginali sono state preparate sulle superfici di due vetrini sterili per la colorazione di Gram. I tamponi vaginali sono stati inoculati direttamente su piastre Petri contenenti Sabouraud dextrose agar medium (Difco, Detroit, USA), così come su piastre Petri contenenti CHROMagar Candida (Parigi, Francia) per facilitare l’isolamento di Candida spp. Tutte le colture sono state incubate per 10 giorni a 37°C. Dopo gli esami clinici e di laboratorio, lo IUD è stato rimosso in condizioni antisettiche ed esaminato al microscopio elettronico a scansione. La rimozione è stata eseguita senza toccare lo IUD con la parete vaginale o lo strumento di apertura per evitare la contaminazione da parte della flora vaginale. Immediatamente dopo la rimozione dello IUD la paziente è stata trattata per via orale con una singola dose da 150 mg di fluconazolo. Tre mesi dopo la rimozione dello IUD, la paziente è tornata per un secondo esame ginecologico, dove non ha presentato segni o sintomi suggestivi di RVVC e gli esami di laboratorio del secreto vaginale erano negativi per i lieviti.

Isolamento e identificazione dei lieviti

I lieviti isolati dai campioni di secrezione delle pazienti sono stati identificati sulla base della produzione in provetta in siero fetale di vitello a 37°C per 2 ore, produzione di camidospore su agar di farina di mais (Oxoid) contenente Tween 80 (Sigma) secondo il metodo Dalmau, assimilazione di fonti di carbonio, come raccomandato da Kurtzman e Fell, 1998 e l’uso del test commerciale API 20C AUX kit (bioMérieux). Per scopi comparativi, Candida dubliniensis, gli isolati sono stati messi in striscia sulla superficie della piastra SDA agar (Difco, Detroit, MI, USA) e incubati a 42°C come precedentemente descritto. Tutti gli isolati recuperati erano suggestivi di Candida albicans e per confermare questa identificazione, gli studi PCR sono stati eseguiti come descritto in precedenza con il primer oligonucleotidico specie-specifico avanti CAL5 (5′ TGT TGC TCT CTG GGG GGC GGC CG 3′) e NL4CAL (5′ AAG ATC ATT ATG CCA ACA TCC TAG GTA AA 3′) primer inverso per Candida albicans confermato. Il ceppo 90028 della American Type Culture Collection (ATCC) Candida albicans è stato usato come controllo. Il metodo PCR utilizzato è stato eseguito in accordo con quello descritto da Mannarelli e Kurtzman.

Microscopia elettronica a scansione

Le IDU sono state lavate con acqua sterile per rimuovere le cellule di lievito non aderenti. I biofilm formati sulle IDU sono stati fissati con 2,5% (v/v) di glutaraldeide in 0,15 M PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Sono stati poi trattati con tetrossido di osmio all’1% (v/v) per 1 ora, lavati tre volte con acqua distillata, trattati con acetato di uranile all’1% (v/v) per 1 ora e lavati nuovamente con acqua distillata. I campioni sono stati poi disidratati in etanolo. Tutti i campioni sono stati essiccati fino al punto critico, sottoposti a metallizzazione con rivestimento in oro, e le osservazioni sono state fatte con il microscopio elettronico a scansione JEOL-JSM 6100 (Jeol Ltda, Tokyo, Giappone) presso l’Istituto di Scienze Biomediche dell’Università di San Paolo, Brasile.

Test di suscettibilità

Gli agenti antimicotici usati in questo studio erano l’amfotericina B (Sigma, St. Louis MO, USA) e il fluconazolo (Pfizer Central Research, New York, USA). Il test di suscettibilità è stato eseguito come descritto nel documento M27-A3 . Le soluzioni stock sono state preparate in acqua (per il fluconazolo) e in dimetil solfossido (per l’amfotericina B). Ulteriori diluizioni di ciascun agente antifungino sono state preparate con RPMI 1640 medium 0,2% glucosio (Sigma) che era stato tamponato a pH 7,0 con 0,165 M acido morfolinopropansolfonico (Sigma), con L-glutamina e rosso fenolo come indicato nel documento M27-A3 (2008). Le diluizioni del farmaco (contenenti il doppio della concentrazione finale) sono state dispensate in piastre di microdiluizione a 96 pozzetti che sono state sigillate e conservate congelate a -70°C fino al giorno del test. I lieviti sono stati successivamente subcoltivati su Sabouraud dextrose agar (Difco), per 24 ore a 35°C prima del test di suscettibilità antifungina. L’inoculo è stato preparato per l’analisi spettrofotometrica, condotta a 530 nm, e la concentrazione finale dell’inoculo di lievito era compresa tra 0,5×103 e 2,5×103 CFU/ml. Le piastre sono state incubate a 35°C per 48 ore in un incubatore senza CO2. I criteri interpretativi per la concentrazione minima inibitoria (MIC) nel test di suscettibilità erano quelli pubblicati nel documento M27-A3 (2008).

Risultati

Il primo esame di laboratorio del secreto vaginale della paziente 1 non ha rivelato la presenza di cellule di lievito, miceli o tricomonadi mobili nel wet mount. L’esame microscopico degli strisci vaginali colorati a Gram ha indicato la presenza di lieviti con blastoconidi e pseudomiceli (Fig. 8A). La Candida albicans è stata identificata con tecniche fenotipiche e confermata con metodi PCR. Il primo esame di laboratorio del secreto vaginale della paziente 2 non ha rivelato la presenza di cellule di lievito e di tricomonadi mobili. L’esame degli strisci colorati di Gram ha dimostrato la presenza di lieviti con blastoconidi (Fig. 8B), che sono stati successivamente identificati come Candida albicans, confermati dal metodo PCR. Dopo la rimozione degli IUD, i lieviti non sono stati trovati al secondo esame di laboratorio delle secrezioni vaginali di entrambe le pazienti. I risultati dei test di suscettibilità in vitro in condizioni planctoniche dei due ceppi di Candida albicans recuperati nell’ambito dei primi esami di laboratorio hanno rivelato che erano suscettibili agli agenti antifungini testati. Le MIC del ceppo isolato dal paziente 1 erano 0,25 µg/ml per l’amfotericina B e 0,5 µg/ml per il fluconazolo. Le MIC dell’isolato dal paziente 2 erano 0,5 µg/ml per l’amfotericina B e 2,0 µg/ml per il fluconazolo. La Fig. 1 mostra il dispositivo intrauterino della paziente 1 prima della microscopia elettronica a scansione. L’esame ha rivelato un biofilm eterogeneo aderente (Figg. 2A, 2B, 3 e 4) sulla superficie della bobina di rame dello IUD. L’analisi del biofilm ha rivelato la presenza di una grande varietà di tipi morfologici di batteri che erano incorporati in una matrice fibrosa (Fig. 3), con vari tipi di cellule – leucociti polimorfonucleati e fibrina. Sulla superficie del biofilm sono stati osservati anche lieviti aderenti (Fig. 4). Le Figg. 5-7 mostrano i risultati del microscopio elettronico a scansione con lo IUD della paziente 2. Ancora una volta, è stata notata un’ampia varietà di tipi morfologici di cellule e microrganismi, incorporati in una matrice fibrosa presente sulla superficie della spirale superiore. La Fig. 6 mostra un grande aggregato di cellule e microrganismi misti sullo IUD, mentre la Fig. 7 mostra anche il lievito presente sulla superficie della spirale superiore della paziente 2.