Biol Res 44:195-199, 2011
Cultura estesa fino allo stadio di blastocisti: una strategia per evitare gravidanze multiple nelle tecnologie di riproduzione assistita
Soledad J Sepúlveda, Jimmy R Portella, Luis P Noriega, Ernesto L Escudero & Luis H Noriega
Gruppo di Riproduzione Assistita PRANOR.
ABSTRACT
Lo scopo di questo studio è stato quello di rivedere l’esperienza e i risultati dei cicli di riproduzione assistita con embrioni cresciuti fino al quinto giorno di sviluppo, confrontando diversi parametri a seconda dell’età dei pazienti.
Abbiamo studiato retrospettivamente 1.874 cicli di riproduzione assistita in cui la cultura embrionale è stata estesa fino al quinto o sesto giorno di sviluppo. Sono stati inclusi tutti i cicli IVF e ICSI, confrontando, in base all’età della paziente, i seguenti tassi: formazione di blastocisti, gravidanza, impianto e aborto. Come controllo, abbiamo analizzato i cicli con ovociti donati da giovani donatori (OD). Il numero di embrioni che raggiungono lo stadio di blastocisti è simile in tutti i gruppi di pazienti. Solo il gruppo OD era diverso in termini di formazione di blastocisti, gravidanza e tassi di impianto. Le pazienti con più di 39 anni hanno avuto un tasso di aborto del 59,1%, che è significativamente più alto degli altri gruppi.
La coltura embrionale prolungata fino allo stadio di blastocisti può essere implementata nei programmi di riproduzione assistita per aumentare il tasso di gravidanza. Il potenziale di impianto della blastocisti è alto, permettendoci di trasferire meno embrioni e ridurre la probabilità di gravidanze multiple.
Parole chiave: blastocisti, coltura a lungo termine, tasso di gravidanza, tasso di impianto.
INTRODUZIONE
La sfida delle tecniche di riproduzione assistita (ART) è di evitare gravidanze multiple, che potrebbero essere causate dall’alto numero di embrioni trasferiti. Pertanto, l’obiettivo è auspicabilmente quello di trasferire un solo embrione, ma ben selezionato. In generale, i laboratori di riproduzione assistita selezionano gli embrioni da trasferire in base alla morfologia, poiché è l’unico strumento semplice. Tuttavia, una buona morfologia non è sempre legata al risultato dell’embrione e può comportare aneuploidie multiple.
Nell’ultimo decennio, sono stati sviluppati sistemi di coltura che permettono uno sviluppo esteso fino allo stadio di blastocisti e quindi la selezione dei migliori embrioni da trasferire (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). Tuttavia, lo sviluppo umano precoce è inefficiente e solo pochi zigoti raggiungono lo stadio di blastocisti e l’impianto. Pertanto, un embrione che si sviluppa fino allo stadio di blastocisti subisce una selezione spontanea durante la coltura in vitro.
FORMAZIONE DI BLASTOCISTI
Dopo aver attraversato la provetta, l’embrione è una morula. Nei blastomeri periferici, si stabiliscono delle giunzioni strette che sigillano lo spazio tra le cellule esterne che formano i trofoblasti. La sigillatura impedisce la diffusione di materiale intercellulare nello spazio extraembrionale e così si forma la cavità del blastocoel. La morula, composta da un solo tipo di cellule, si trasforma in una blastocisti, dove si riconoscono due tipi di cellule. I blastomeri periferici formano un epitelio appiattito chiamato trofoblasto, e i blastomeri centrali formano la massa cellulare interna. Queste cellule danno origine all’embrione stesso e a parte degli annessi embrionali. Il trofoblasto dà origine alla maggior parte degli annessi. La blastocisti umana espansa contiene più di 90 cellule, di cui circa il 10% forma la massa cellulare interna (figura 1) (Sepúlveda, 2008).
La cavità del blastocoel è formata dalla confluenza di vacuoli. Cresce grazie all’azione della Na+ / K+ ATPasi situata nella membrana delle cellule del trofoblasto. Gli ioni Na+ entrano nella cavità, che inizia a incorporare acqua per mantenere l’equilibrio osmotico. Il movimento dell’acqua durante la cavitazione può anche essere facilitato da acquaporine nelle membrane apicale e basolaterale nel trofectoderma (Barcroft et al., 2003). Così, la cavità si espande e inizia a schiudersi, dopo di che l’embrione aderisce alla superficie dell’endometrio, invadendo e prendendo contatto con il sistema vascolare della madre durante l’impianto. Questa procedura può durare un paio di giorni e passa attraverso le fasi illustrate nella Figura 1. In primo luogo, si forma una blastocisti precoce, con una piccola cavità, che cresce fino a formare una blastocisti completa. Da questa fase, si comincia a classificare il numero di cellule del trofoblasto e della massa cellulare interna. Inizia l’espansione e infine la schiusa attraverso la zona pellucida (Figura 1). Questa classificazione permette di selezionare le blastocisti per il trasferimento che hanno un maggiore potenziale di crescita. La logica alla base del prolungamento della coltura embrionale fino al quinto giorno non è quella di migliorarne la qualità, ma di aumentare la probabilità di scegliere l’embrione con miglior potenziale di impianto.
ADVANTAGGI DELLA COLTURA ESTESA A BLASTOCISTI
È importante avere un metodo di screening embrionale che permetta di trasferire il numero minimo di embrioni senza compromettere le possibilità di gravidanza. Lo sviluppo di mezzi con cui gli embrioni crescono per periodi più lunghi, fino allo stadio di blastocisti, permette di selezionare i migliori embrioni da trasferire. Così, ha aumentato i tassi di impianto e ridotto le gestazioni multiple. Una meta-analisi, che ha valutato 18 studi randomizzati e controllati, ha riportato che c’è una differenza significativa nei tassi di gravidanza e parti vivi per i trasferimenti al 5° giorno rispetto ai trasferimenti al 3° giorno (Blake et al., 2007).
L’idea che i media sequenziali siano necessari per uno sviluppo embrionale ottimale ha un fascino intuitivo, ma non è supportata da prove sperimentali dirette (Biggers et al., 2005). In tali sistemi di coltura di media sequenziali, il mezzo usato per la coltura degli embrioni dal 1° al 3° giorno di sviluppo differisce per composizione e/o concentrazione di componenti dal mezzo usato per la coltura successiva dal 3° giorno allo stadio di blastocisti (Gardner & Lane, 1997, 1998). Abbiamo dimostrato che lo sviluppo in vitro fino allo stadio di blastocisti e i successivi tassi di impianto sono migliori per gli embrioni umani coltivati in un unico mezzo che per quelli coltivati in un sistema di mezzi sequenziali (Sepúlveda et al., 2009). La fecondazione non avviene allo stesso tempo in tutti gli ovuli, quindi il tempo di ogni embrione è diverso. Perciò sarebbe meglio un unico mezzo, dove l’embrione usa ciò di cui ha bisogno.
Ci sono diversi vantaggi per la cultura fino allo stadio di blastocisti. Come discusso in precedenza, la coltura a lungo termine ci permette di distinguere gli embrioni vitali con il maggior potenziale di impianto da quelli che si sono sviluppati inizialmente ma che muoiono più tardi. Permette anche di valutare l’attivazione genomica dell’embrione (Braude et al., 1988), cercando gli embrioni che non raggiungono lo stadio di 8 cellule. Le prove dimostrano che c’è un tasso inferiore di aborto precoce quando vengono trasferite blastocisti (Papanikolaou et al., 2006).
In vivo, gli embrioni allo stadio di clivaggio sono di solito nelle tube di Falloppio, non nell’utero, motivo per cui la sincronizzazione del trasferimento di embrioni allo stadio di blastocisti con l’ambiente uterino è più fisiologico (Gardner et al., 1996). Un altro vantaggio della coltura a lungo termine è il tempo prolungato, che permette il trasferimento quando i blastomeri vengono rimossi al 3° giorno per la diagnosi genetica preimpianto.
Lo scopo di questo studio è stato quello di rivedere l’esperienza e i risultati dei cicli di riproduzione assistita con embrioni al 5° giorno di sviluppo, confrontando vari parametri in base all’età della paziente.
MATERIALI E METODI
Abbiamo studiato retrospettivamente 1.874 cicli di riproduzione assistita in cui sono stati coltivati embrioni fino al quinto o sesto giorno di sviluppo, comprese le procedure di donazione di ovociti (OD, n = 1.192; 2004 – 2010), fecondazione in vitro (IVF) e iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI) (n = 682, 2008-2010).
Sono stati confrontati i seguenti tassi in base all’età della paziente: formazione di blastocisti, gravidanza, impianto e aborto.
Inseminazione / iniezione
Per l’inseminazione nella FIV convenzionale, circa 100.000 spermatozoi sono stati co-culturati con complessi cumulo-corona-oocita. Per l’ICSI, sono stati iniettati solo gli ovociti in metafase II (MII), utilizzando le procedure descritte in precedenza (Sepúlveda et al., 2009).
Cultura di embrioni
Gli ovociti fecondati (2PN) sono stati coltivati individualmente in gocce di 10 |UL Global® media (Global Life, Canada) integrato con il 10% di siero sintetico sostitutivo (SSS). Il giorno 3, gli embrioni sono stati cambiati in un terreno Global® fresco. La cultura era sotto olio minerale a 37 ° C in un’atmosfera di 6,5 % CO2, 5 % O2 e 88,5 % N2. Le valutazioni dello sviluppo embrionale sono state condotte secondo le procedure descritte (Sepúlveda et al., 2009).
Trasferimento embrionale
I trasferimenti embrionali sono stati effettuati il 5° o 6° giorno di coltura embrionale, utilizzando un catetere Frydman Ultrasoft (CCD Laboratories, Francia). Uno o due embrioni sono stati selezionati per il trasferimento. Se erano disponibili più embrioni, sono stati congelati o vitrificati.
Definizione dei parametri analizzati
Il tasso di formazione di blastocisti è il numero totale di blastocisti sul totale degli ovociti 2PN. Il tasso di gravidanza è stato definito come il numero di cicli con almeno un sacco gestazionale tra il numero di cicli trasferiti. Il tasso di aborto è stato definito come il numero di gravidanze con perdita totale dei sacchi gestazionali prima delle 20 settimane di gestazione tra il numero di gravidanze. Il tasso di impianto è stato calcolato in base al numero di sacchi gestazionali sul numero totale di embrioni trasferiti.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il pacchetto statistico STATA 10.0 (StataCorp LP, 4905 Lakeway Drive, College Station, TX, USA). La normalità della distribuzione delle variabili continue è stata valutata con un test Kolmogorov-Smirnov. Le variabili continue sono state valutate con una statistica parametrica (t-test di Student) o non parametrica (Mann-Whitney Rank Sum Test). Per le variabili non continue, è stato utilizzato il test chi-quadro o il test esatto di Fisher. Le differenze sono state considerate significative con un p-value di <0.05.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Nel programma di donazione di ovociti, le colture di blastocisti sono iniziate nel 2004 con il 4 % dei cicli. Attualmente, la coltura estesa fino allo stadio di blastocisti è diventata una tecnica di routine, verificandosi nel 90 % dei casi nel 2010 (Figura 2).
La tabella 1 descrive i 4 gruppi che sono stati confrontati. Pazienti sotto i 35 anni, pazienti tra i 34 e i 39 anni, pazienti sopra i 39 anni e pazienti che hanno ricevuto ovociti da donatori giovani (OD). Il numero di ovociti ottenuti all’aspirazione follicolare, come previsto, è diminuito con l’età. La percentuale di cicli in cui l’ICSI è stata utilizzata come metodo di inseminazione era simile in tutti i gruppi (Tabella 1).
Il numero di embrioni che hanno raggiunto lo stadio di blastocisti era simile nei tre gruppi di pazienti con una tendenza a diminuire in base all’età. Tuttavia, quando l’ovocita apparteneva ad una donatrice (OD), il tasso di formazione delle blastocisti aumentava di oltre il 40% (p< 0,05). Il tasso era del 40% tra i pazienti più giovani e solo del 34% tra i pazienti più anziani (Tabella 2). In contrasto con i nostri risultati, Thomas et al. (2010) hanno riferito che l’età del paziente era negativamente associata alla formazione di blastocisti. Allo stesso modo, la percentuale di embrioni crioconservati è più alta tra il gruppo OD e i pazienti sotto i 35 anni che tra i pazienti sopra i 35 anni (Tabella 2).
La percentuale di cicli con trasferimenti cancellati era circa il 15% tra i pazienti sopra i 34 anni di età (Figura 3). Le cancellazioni potrebbero essere dovute al basso numero di ovociti ottenuti durante il prelievo degli ovociti, che porta a meno o nessun embrione disponibile, rispetto al prelievo con donne più giovani. Tuttavia, alcuni rapporti hanno dimostrato che il trasferimento di blastocisti può essere applicabile a qualsiasi paziente senza compromettere la probabilità di trasferimento embrionale o di gravidanza (Marek et al., 1999; Wilson et al, 2002).
Il tasso di gravidanza variava secondo l’età della paziente: 48.4% per le donne sotto i 35 anni e 38,6% per le donne sopra i 39 anni (Figura 4). Quando i cicli sono stati fatti con ovociti donati da donne giovani, il tasso di gravidanza è salito al 58,1%, un valore superiore a quello di tutti i gruppi di pazienti (p <0,005).
In questo studio, il numero massimo di embrioni trasferiti è stato di due, che è la nostra politica dal 2004 per evitare il rischio di gravidanze multiple. L’alto tasso di impianto mostrato in tutti i gruppi riflette il maggiore potenziale di impianto degli embrioni trasferiti nel quinto giorno (Figura 4), dimostrato anche da altri studi (Gardner et al., 1998; Blake et al., 2007). Tuttavia, il tasso di impianto è inferiore nelle pazienti rispetto al gruppo OD. Questo può essere spiegato da ulteriori fattori legati alla causa dell’infertilità nelle pazienti (Marino et al., 2011), dato che le donatrici di ovuli sono giovani donne senza apparenti problemi riproduttivi. Inoltre, ci sono prove di gravi cambiamenti nello sviluppo endometriale nei cicli stimolati (Haouzi et al., 2010). Questo può essere vantaggioso per le riceventi nel gruppo OD perché non sono state stimolate.
Anche se il tasso di gravidanza per le pazienti anziane è alto con il trasferimento di blastocisti, il tasso di aborto è del 59,1%, che è significativamente più alto rispetto ai tassi degli altri gruppi (Figura 5).
Questo studio, come altri, ha dimostrato un calo della fertilità per le donne oltre i 35 anni di età (Van Noord-Zaadstra et al, 1991; Perheentupa & Huhtaniemi, 2099), che è significativamente inferiore al declino tra le donne di oltre 40 anni (Marcus & Brinsden, 1996). D’altra parte, la minore probabilità di ottenere una gravidanza di successo legata all’aumento dell’età materna è caratterizzata da una maggiore prevalenza di anomalie cromosomiche nell’ovocita che portano in definitiva ad una significativa riduzione dei tassi di impianto (Munné, 2002) e ad alti tassi di aborto spontaneo (Munné et al., 1995; Nybo-Andersen et al, 2000).
CONCLUSIONI
La coltura embrionale estesa allo stadio di blastocisti può essere implementata in un programma di riproduzione assistita per aumentare la probabilità di gravidanza nelle pazienti, perché la selezione naturale può avvenire durante la coltura embrionale.
Il potenziale di impianto della blastocisti è alto, permettendoci di trasferire meno embrioni e ridurre la probabilità di gravidanze multiple. La coltura di blastocisti è un’alternativa che permette di scegliere un solo embrione da trasferire nelle donne giovani.
Il tasso di cancellazione è più alto tra le pazienti di età superiore ai 35 anni, forse a causa della diminuzione della riserva ovarica e del minor numero di ovociti ottenuti, dato che gli embrioni raggiungono lo stadio di blastocisti indipendentemente dall’età della paziente.
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