Come progettare un primer

Primer Design per PCR

I primer oligonucleotidici sono necessari quando si esegue una reazione PCR. Si devono progettare primer che siano complementari alla regione di DNA modello. Sono sintetizzati chimicamente unendo i nucleotidi insieme. Si devono bloccare e sbloccare selettivamente e ripetutamente i gruppi reattivi su un nucleotide quando si aggiunge un nucleotide alla volta. La principale proprietà dei primer è che devono corrispondere a sequenze sulla molecola modello (devono essere complementari al filamento modello). Tuttavia, non è necessario che i primer corrispondano completamente al filamento modello; è essenziale, tuttavia, che l’estremità 3′ del primer corrisponda completamente al filamento di DNA modello in modo che l’allungamento possa procedere. Di solito si usa una guanina o una citosina all’estremità 3′, e l’estremità 5′ del primer di solito ha tratti di diversi nucleotidi. Inoltre, entrambe le estremità 3′ dei primer ibridati devono puntare l’una verso l’altra.

Anche la dimensione del primer è molto importante. I primer corti sono usati principalmente per amplificare un piccolo e semplice frammento di DNA. D’altra parte, un primer lungo è usato per amplificare un campione di DNA genomico eucariotico. Tuttavia, un primer non dovrebbe essere troppo lungo (> primer da 30-mer) o troppo corto. I primer corti producono un prodotto di amplificazione del DNA impreciso e aspecifico, mentre i primer lunghi comportano un tasso di ibridazione più lento. In media, il frammento di DNA che deve essere amplificato dovrebbe essere entro 1-10 kB di dimensione.

La struttura del primer dovrebbe essere relativamente semplice e non contenere alcuna struttura secondaria interna per evitare il ripiegamento interno. Bisogna anche evitare l’annealing primer-primer che crea dimeri del primer e interrompe il processo di amplificazione. Quando si progetta, se non si è sicuri di quale nucleotide mettere in una certa posizione all’interno del primer, si può includere più di un nucleotide in quella posizione chiamata sito misto. Si può anche usare un inserto molecolare a base di nucleotidi (inosina) invece di un normale nucleotide per avere più ampie capacità di accoppiamento.

Prendendo in considerazione le informazioni di cui sopra, i primer dovrebbero generalmente avere le seguenti proprietà:

• Lunghezza di 18-24 basi
• 40-60% di contenuto G/C
• Inizio e fine con 1-2 coppie G/C
• Temperatura di fusione (Tm) di 50-60°C
• Le coppie di primer dovrebbero avere una Tm entro 5°C l’una dall’altra

• Le coppie di primer non dovrebbero avere regioni complementari

  Nota: Se si include un sito di restrizione all’estremità 5′ del primer, si noti che un “clamp” di 3-6 coppie di basi deve essere aggiunto a monte per consentire all’enzima di tagliare in modo efficiente (es.GCGGCG – sito di restrizione – la tua sequenza).

.