7.19.2.1 Cloroformio (Triclorometano)
Il cloroformio è usato come solvente industriale e come intermedio nella fabbricazione di materiali polimerici. L’uso principale del cloroformio oggi è nella produzione del refrigerante R-22, comunemente usato nel settore dell’aria condizionata. Rapporti di diversi laboratori hanno dimostrato che la nefrotossicità acuta del cloroformio è specie, ceppo e genere-dipendente (Eschenbrenner e Miller 1945; Hill et al. 1975; Larson et al. 1993, 1994; Pohl et al. 1984; Smith et al. 1983, 1984; Torkelson et al. 1976), e che i topi maschi sono più suscettibili di ratti, conigli o cani, mentre i topi femmina sono resistenti. Il rigonfiamento tubulare, la necrosi e i calchi, localizzati principalmente nei tubuli prossimali, sono i principali cambiamenti istopatologici nel rene dopo l’esposizione degli animali da esperimento al cloroformio. La nefrotossicità indotta dal cloroformio è anche associata a elevate concentrazioni di azoto ureico nel sangue, proteinuria e glucosuria. L’assorbimento in vitro di anioni e cationi organici da parte di fette di corticale renale è anche inibito dal trattamento in vivo con cloroformio (Kluwe e Hook 1978). Mentre l’esposizione umana al cloroformio è stata associata a oliguria, proteinuria, aumento dell’azoto ureico nel sangue e necrosi tubulare renale, la dose soglia per la tossicità renale acuta del cloroformio negli esseri umani è sconosciuta. La localizzazione della lesione renale umana ai tubuli prossimali suggerisce un meccanismo comune di nefrotossicità del cloroformio nella maggior parte delle specie di mammiferi.
Sono state descritte entrambe le vie ossidative e riduttive del metabolismo del cloroformio, sebbene i dati in vivo siano limitati. Il diossido di carbonio è il principale metabolita del cloroformio generato dalla via ossidativa del metabolismo in vivo. La via ossidativa genera anche metaboliti reattivi, compreso il fosgene (Pohl e Krishna 1978; Pohl et al. 1977), che è stato determinato in vitro con induzione di fenobarbital (Testai e Vittozzi 1986; Tomasi et al. 1985; Wolf et al. 1977), mentre la via riduttiva genera il radicale libero diclorometilcarbene (determinato in vitro e in vivo, sia con che senza induzione di fenobarbital). Il metabolismo ossidativo e quello riduttivo procedono entrambi attraverso una fase di attivazione enzimatica dipendente dal citocromo P450 (CYP). L’equilibrio tra le vie ossidativa e riduttiva dipende dalla specie, dal tessuto, dalla dose e dalla tensione di ossigeno (Ammann et al. 1998; Testai e Vittozzi 1986). Nei mammiferi intatti, la tensione ossidativa probabilmente preclude qualsiasi metabolismo significativo attraverso la via riduttiva (Mansuy et al. 1977; Pohl et al. 1977). Il fosgene è prodotto dalla declorazione ossidativa del cloroformio a triclorometanolo, che si deidroclora spontaneamente. La deidroclorurazione del triclorometanolo produce una molecola di acido cloridrico, e l’idrolisi del fosgene produce altre due molecole, così che tre molecole di acido cloridrico sono prodotte nella conversione del cloroformio in anidride carbonica (Pohl et al. 1980).
Il metabolita elettrofilo fosgene si lega covalentemente ai componenti nucleofili delle proteine dei tessuti (Uehleke e Werner 1975; Vittozzi et al. 1991). Interagisce anche con altri nucleofili cellulari e si lega in una certa misura alle teste polari dei fosfolipidi (Brown et al. 1974; Fry et al. 1972). In alternativa, il fosgene reagisce con l’acqua per rilasciare anidride carbonica e acido cloridrico (Ahmed et al. 1977; Anders et al. 1978; Pohl et al. 1981). L’interazione del fosgene con il glutatione (GSH) porta alla formazione di S-clorocarbonile GSH, che può interagire con un ulteriore GSH per formare diglutathionil ditiocarbonato o formare disolfuro GSH e monossido di carbonio (Smith e Hook 1984). L’incubazione di microsomi renali di topo con GSH aumenta la produzione di questi metaboliti dal cloroformio e diminuisce il legame irreversibile alle proteine e l’ulteriore metabolismo in anidride carbonica (Vittozzi et al. 1991). Il GSH ridotto è in grado di eliminare essenzialmente tutti i metaboliti del cloroformio prodotti nelle incubazioni con microsomi di fegato di topo quando le concentrazioni di cloroformio non sono troppo alte. L’importanza relativa delle vie minori del metabolismo del fosgene dipende dalla disponibilità di GSH, altri tioli e altri composti nucleofili, come l’istidina e la cisteina (Figura 1).
Figura 1. Possibili vie di metabolismo del cloroformio nel rene.
Il metabolismo ossidativo, con il CYP2E1 (un sistema di isoenzima monoossigenasi etanolo-riducibile presente nel fegato dei mammiferi, compreso l’uomo) che gioca un ruolo chiave, è probabilmente l’unica via significativa in vivo a basse esposizioni, e i dati disponibili indicano che il metabolismo ossidativo ha un ruolo importante nella tossicità (Brady et al. 1989; Constan et al. 1999; Guengerich et al. 1991; Nakajima et al. 1995). Il ruolo dominante del CYP2E1 nel metabolizzare il cloroformio in metaboliti tossici è stato dimostrato in studi che hanno coinvolto il trattamento di animali con induttori o inibitori dell’enzima, così come studi su topi privi di CYP2E1 (Brady et al. 1989). Studi di immunoinibizione con proteina monoclonale anti-CYP2E1 hanno dimostrato che il CYP2E1 è responsabile dell’81% del metabolismo testato ad una bassa concentrazione di cloroformio (0,5 mmol l-1) nei microsomi epatici di ratti con acetone (Ammann et al. 1998). La tossicità agli epatociti di ratto e topo incubati in vitro con cloroformio fino a 5 mmol l-1 è stata prevenuta dall’aggiunta di un inibitore CYP2E1 o da una ridotta tensione di ossigeno, sottolineando l’importanza del metabolismo ossidativo nella tossicità (Dicker et al. 1991; Ingelman-Sundberg et al. 1988; Johansson et al. 1990; Nakajima et al. 1995; Smith et al. 1979; Tsutsumi et al. 1989). La distribuzione regionale delle lesioni epatiche nei ratti e nei topi è ben correlata alla distribuzione epatica del CYP2E1 e del GSH.
Il CYP2B1 può anche avere un ruolo nel metabolismo del cloroformio, sebbene questo sia probabilmente solo minore a basse concentrazioni di cloroformio nei tessuti (Nakajima et al. 1995). Tuttavia, ad alte concentrazioni tissutali (per esempio, risultanti da una dose orale di 0,5 ml kg-1), l’epatotossicità del cloroformio era drammaticamente potenziata nei ratti Wistar trattati con fenobarbital (un induttore del CYP2B1) ma non nei ratti trattati con n-esano (un induttore del CYP2E1), rispetto ai controlli non indotti (Lofberg e Tjalve 1986). Uno studio in cui i ratti sono stati esposti al cloroformio ha mostrato che il metabolismo era più attivo nel fegato, seguito dal naso e dai reni. L’attività metabolica era correlata all’accumulo di metaboliti.
Anche se la bioattivazione del cloroformio in metaboliti nefrotossici potrebbe potenzialmente avvenire sia nel fegato che nel rene, diversi studi hanno dimostrato che l’epatotossicità e la nefrotossicità indotte dal cloroformio possono essere modulate diversamente da vari trattamenti farmacologici, chimici o ormonali, suggerendo che il cloroformio è bioattivato da meccanismi indipendenti nel fegato e nel rene (Bailie et al. 1984). Il metabolismo renale del cloroformio da parte degli enzimi P450 è ben correlato alla nefrotossicità indotta dal cloroformio (Ahmadizadeh et al. 1981; Pohl et al. 1984; Smith et al. 1983). La capacità del CYP2E1 umano di metabolizzare il cloroformio in vitro è stata dimostrata (Gonzalez e Gelboin 1994). Quindi, i risultati che il livello di questo enzima nel rene del topo maschio è significativamente più alto di quello del topo femmina e che il trattamento dei topi femmina con testosterone, che potenzia la nefrotossicità del cloroformio nei topi femmina, aumenta significativamente questo enzima nel rene del topo femmina (Hu et al. 1993) suggeriscono un ruolo del CYP2E1 renale nella nefrotossicità indotta dal cloroformio. Il grado di espressione del CYP2E1 nel rene umano e la sua regolazione da parte di vari fattori genetici, nutrizionali e ambientali deve ancora essere determinato. Gli enzimi CYP, diversi dal CYP2E1, possono anche metabolizzare il cloroformio. La disponibilità di diversi CYP umani espressi in cDNA dovrebbe rendere possibile l’identificazione di ulteriori isoforme CYP che possono essere coinvolte nella bioattivazione del cloroformio. Questi studi possono aiutare a determinare quale specie animale potrebbe essere un modello adatto a valutare il rischio per gli esseri umani. Inoltre, poiché le macromolecole sono bersagli dell’alchilazione del fosgene, l’identificazione dei bersagli critici può consentire una migliore comprensione di come la modifica covalente delle macromolecole renali da parte del fosgene può portare alla necrosi cellulare (Anand et al. 2006; Philip et al. 2006). Studi recenti hanno dimostrato che l’adescamento subcronico al cloroformio protegge i topi da una dose letale di cloroformio successivamente somministrata. Gli autori hanno dimostrato che il priming iniziale ha stimolato la divisione cellulare renale e la riparazione dei tessuti. Questa riparazione renale è stata sostenuta anche dopo la somministrazione di una successiva dose letale di cloroformio.
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