Abstrait
Un biofilm est une communauté complexe de cellules associées à une surface et enfermées dans une matrice polymère. Elles se fixent sur des surfaces solides et leur formation peut être affectée par les conditions de croissance et la co-infection avec d’autres agents pathogènes. La présence d’un biofilm peut protéger les micro-organismes des défenses de l’hôte et réduire considérablement leur sensibilité aux agents antifongiques. Les microbes pathogènes peuvent former des biofilms sur les surfaces inertes des dispositifs implantés tels que les cathéters, les valves cardiaques prothétiques et les dispositifs intra-utérins (DIU). La présente étude a été menée pour analyser la présence de biofilms sur la surface de dispositifs intra-utérins chez des patientes souffrant de candidoses vulvo-vaginales récurrentes, et pour déterminer le profil de sensibilité des levures isolées à l’amphotéricine B et au fluconazole. Candida albicans a été récupéré sur les DIU et s’est révélé sensible aux agents antifongiques lorsqu’il a été testé dans des conditions de croissance planctonique. Ces résultats indiquent la présence du biofilm à la surface du DIU comme un facteur de risque important de candidose vulvo-vaginale récurrente.
Introduction
Le biofilm est une structure complexe qui peut être produite par divers micro-organismes, y compris les membres du genre Candida. Sa production varie en fonction de l’environnement et du substrat disponible . Les biofilms s’attachent aux surfaces solides et leur formation peut être affectée par les conditions de croissance et la co-infection avec d’autres microorganismes . La présence de biofilms peut servir de réservoir de micro-organismes et peut également entraîner une résistance aux agents antimicrobiens. Bien que les biofilms bactériens aient été étudiés en détail, peu d’études ont été réalisées sur les biofilms fongiques liés à la médecine. Les dispositifs intra-utérins (DIU) sont la méthode la plus couramment utilisée pour empêcher la fécondation. Le présent article décrit deux cas de patientes présentant des signes et des symptômes de candidose vulvo-vaginale récurrente (CVVR) qui utilisaient des DIU comme méthode contraceptive. Après leur retrait, les DIU ont été analysés pour la présence de biofilm sur leurs surfaces, et le profil de sensibilité des levures récupérées sur les dispositifs a été étudié.
Matériel et méthodes
Patientes
Deux patientes présentant des signes et des symptômes évocateurs de RVVC, définis par au moins quatre épisodes symptomatiques en 1 an , ont été recrutées dans la présente étude après avoir obtenu l’approbation du conseil d’examen institutionnel. Les études microbiologiques ont été réalisées à l’hôpital de l’Université de São Paulo, São Paulo, Brésil.
Cas 1
La patiente était âgée de 29 ans, mariée,avec deux enfants et présentait des symptômes cliniques évocateurs de RVVC (présence de pertes vaginales, prurit vulvaire, démangeaisons et érythème). Elle s’est révélée négative pour l’infection par le VIH et le diabète sucré. La patiente utilisait le DIU depuis trois ans et un mois comme méthode contraceptive et a déclaré que les symptômes avaient commencé peu après l’implantation du dispositif. Ces symptômes se sont intensifiés au cours de la dernière année, principalement en termes de prurit et d’écoulement. La patiente a mentionné que lors de plusieurs visites gynécologiques précédentes, elle avait été traitée au fluconazole. Au cours de l’examen gynécologique actuel, un échantillon des sécrétions du vagin de la patiente a été prélevé à l’aide d’écouvillons stériles sur les parois latérales du vagin et le fond de la poche vaginale, à l’aide d’un spéculum non lubrifié. Le matériel clinique a été fraîchement prélevé pour un examen immédiat dans 3 ml de solution saline stérile (NaCl 0,85%). Les sécrétions vaginales ont été préparées sur les surfaces de deux lames stériles pour la coloration de Gram. Les écouvillons vaginaux ont été directement inoculés sur des boîtes de Pétri contenant un milieu de gélose Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA) ainsi que sur des boîtes de Pétri contenant CHROMagar Candida (Paris, France) afin de faciliter l’isolement des Candida spp. Toutes les cultures ont été incubées pendant 10 jours à 37°C. Le DIU a été retiré de la patiente après des examens gynécologiques et de laboratoire. Le retrait du DIU a été effectué dans des conditions antiseptiques et sans que le DIU ne touche la paroi vaginale ou l’instrument d’ouverture afin d’éviter toute contamination par la flore vaginale. Immédiatement après le retrait du DIU, la patiente a été traitée par voie orale avec une dose unique de 150 mg de fluconazole. Trois mois après le retrait du DIU, la patiente est revenue pour un second examen gynécologique au cours duquel elle n’a pas présenté de signes ou de symptômes évocateurs de RVVC et les examens de laboratoire des sécrétions vaginales se sont révélés négatifs pour les levures.
Cas 2
La patiente était âgée de 38 ans, mariée, et présentait des symptômes cliniques évocateurs de RVVC (présence de pertes vaginales à l’aspect grumeleux et cottage-cheese, prurit et démangeaisons vulvaires). Elle aussi s’est révélée négative pour le VIH et le diabète sucré. La patiente a déclaré que les pertes et les démangeaisons s’étaient aggravées au cours des deux dernières années. Elle utilisait un DIU depuis environ cinq ans comme méthode contraceptive. La patiente a mentionné que lors de visites gynécologiques précédentes, elle avait été traitée au fluconazole. Au cours de l’examen gynécologique, les sécrétions vaginales ont été recueillies avec des écouvillons stériles à l’aide d’un spéculum non lubrifié. Le matériel clinique a été fraîchement prélevé pour un examen immédiat dans 3 ml de solution saline stérile (NaCl 0,85%). Les sécrétions vaginales ont été préparées sur les surfaces de deux lames stériles pour la coloration de Gram. Les écouvillons vaginaux ont été directement inoculés sur des boîtes de Pétri contenant le milieu Sabouraud dextrose agar (Difco, Detroit, USA), ainsi que sur des boîtes de Pétri contenant CHROMagar Candida (Paris, France) afin de faciliter l’isolement des Candida spp. Toutes les cultures ont été incubées pendant 10 jours à 37°C. Après les examens cliniques et de laboratoire, le DIU a été retiré dans des conditions antiseptiques et examiné par microscopie électronique à balayage. Le retrait a été effectué sans toucher le DIU à la paroi vaginale ou à l’instrument d’ouverture pour éviter toute contamination par la flore vaginale. Immédiatement après le retrait du DIU, la patiente a été traitée par voie orale avec une dose unique de 150 mg de fluconazole. Trois mois après le retrait du DIU, la patiente est revenue pour un deuxième examen gynécologique, où elle n’a pas présenté de signes ou de symptômes évocateurs de RVVC et où les examens de laboratoire des sécrétions vaginales étaient négatifs pour les levures.
Isolation et identification des levures
Les levures isolées des échantillons de sécrétion des patientes ont été identifiées sur la base de la production en tubes germinatifs dans du sérum de veau fœtal à 37°C pendant 2 h, la production de chamydospores sur une gélose de farine de maïs (Oxoid) contenant du Tween 80 (Sigma) selon la méthode de Dalmau, l’assimilation de sources de carbone, comme recommandé par Kurtzman et Fell, 1998 et l’utilisation du kit commercial API 20C AUX (bioMérieux). À des fins de comparaison, les isolats de Candida dubliniensis ont été étalés sur la surface d’une plaque de gélose SDA (Difco, Detroit, MI, USA) et incubés à 42°C comme décrit précédemment. Tous les isolats récupérés évoquaient Candida albicans et pour confirmer cette identification, des études PCR ont été réalisées comme décrit précédemment avec l’amorce oligonucléotidique spécifique à l’espèce en avant CAL5 (5′ TGT TGC TCT CTG GGG GGC GGC CG 3′) et l’amorce inverse NL4CAL (5′ AAG ATC ATT ATG CCA ACA TCC TAG GTA AA 3′) pour confirmer Candida albicans. La souche 90028 de Candida albicans de l’American Type Culture Collection (ATCC) a été utilisée comme témoin. La méthode PCR utilisée a été réalisée en accord avec celle décrite par Mannarelli et Kurtzman .
Microscopie électronique à balayage
Les UDI ont été lavées à l’eau stérile pour éliminer les cellules de levure non adhérentes. Les biofilms formés sur les UDI ont été fixés avec 2,5 % (v/v) de glutaraldéhyde dans du PBS 0,15 M pendant 1 h à température ambiante. Ils ont ensuite été traités avec du tétroxyde d’osmium à 1% (p/v) pendant 1 h, lavés trois fois avec de l’eau distillée, traités avec de l’acétate d’uranyle à 1% (p/v) pendant 1 h et lavés à nouveau avec de l’eau distillée. Les échantillons ont ensuite été déshydratés dans de l’éthanol. Tous les échantillons ont été séchés jusqu’au point critique, soumis à une métallisation en couche d’or et des observations ont été réalisées avec le microscope électronique à balayage JEOL-JSM 6100 (Jeol Ltda, Tokyo, Japon) à l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo, Brésil.
Tests de susceptibilité
Les agents antifongiques utilisés dans cette étude étaient l’amphotéricine B (Sigma, St. Louis MO, USA) et le fluconazole (Pfizer Central Research, New York, USA). Les tests de susceptibilité ont été effectués comme décrit dans le document M27-A3 . Les solutions mères ont été préparées dans de l’eau (pour le fluconazole) et du diméthylsulfoxyde (pour l’amphotéricine B). D’autres dilutions de chaque agent antifongique ont été préparées dans un milieu RPMI 1640 contenant 0,2 % de glucose (Sigma), tamponné à pH 7,0 avec de l’acide morpholinopropanesulfonique 0,165 M (Sigma), de la L-glutamine et du rouge de phénol, comme indiqué dans le document M27-A3 (2008). Les dilutions du médicament (contenant le double de la concentration finale) ont été réparties dans des plaques de microdilution à 96 puits qui ont été scellées et conservées congelées à -70°C jusqu’au jour du test. Les levures ont ensuite été mises en subculture sur de la gélose au dextrose de Sabouraud (Difco), pendant 24 h à 35°C, avant de procéder aux tests de sensibilité aux antifongiques. L’inoculum a été préparé pour une analyse spectrophotométrique, réalisée à 530 nm, et la concentration finale de l’inoculum de levures était de 0,5×103 à 2,5×103 CFU/ml. Les plaques ont été incubées à 35°C pendant 48 h dans un incubateur sans CO2. Les critères d’interprétation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’antibiogramme étaient ceux publiés dans le document M27-A3 (2008).
Résultats
Le premier examen de laboratoire de la sécrétion vaginale de la patiente 1 n’a pas révélé la présence de cellules de levure, de mycéliums ou de trichomonades mobiles dans le montage humide. L’examen microscopique des frottis vaginaux colorés par Gram a indiqué la présence de levures avec des blastoconidies et des pseudomycéliums (figure 8A). Candida albicans a été identifié par des techniques phénotypiques et confirmé par des méthodes PCR. Le premier examen de laboratoire de la sécrétion vaginale de la patiente 2 n’a pas révélé la présence de cellules de levure et de trichomonades mobiles. L’examen des frottis colorés au Gram a démontré la présence de levures avec blastoconidies (Fig. 8B), qui ont ensuite été identifiées comme étant Candida albicans, confirmées par la méthode PCR. Après le retrait des DIU, les levures n’ont pas pu être trouvées lors des seconds examens de laboratoire des sécrétions vaginales des deux patientes. Les résultats des tests de sensibilité in vitro en conditions planctoniques des deux souches de Candida albicans récupérées dans le cadre des premiers examens de laboratoire ont révélé qu’elles étaient sensibles aux agents antifongiques testés. Les CMI de la souche isolée du patient 1 étaient de 0,25 µg/ml pour l’amphotéricine B et de 0,5 µg/ml pour le fluconazole. Les CMI de l’isolat du patient 2 étaient de 0,5 µg/ml pour l’amphotéricine B et de 2,0 µg/ml pour le fluconazole. La figure 1 montre le dispositif intra-utérin de la patiente 1 avant la microscopie électronique à balayage. L’examen a révélé un biofilm hétérogène adhérent (Figs. 2A, 2B, 3 et 4) à la surface de la bobine de cuivre du DIU. L’analyse du biofilm a révélé la présence d’une grande variété de types morphologiques de bactéries qui étaient noyées dans une matrice fibreuse (Fig. 3), avec différents types de cellules – leucocytes polymorphonucléaires et fibrine. Des levures adhérentes ont également été observées à la surface du biofilm (Fig. 4). Les figures 5 à 7 montrent les résultats de la microscopie électronique à balayage avec le DIU de la patiente 2. Là encore, on a noté une grande variété de types morphologiques de cellules et de micro-organismes, noyés dans une matrice fibreuse présente à la surface de l’enroulement supérieur. La figure 6 montre un grand agrégat de cellules et de micro-organismes mélangés sur le DIU, tandis que la figure 7 montre également la levure présente à la surface du serpentin supérieur de la patiente 2.
Dispositif intra-utérin retiré de la patiente 1.
Dispositif intra-utérin retiré de la patiente 1.
(A) Microscopie électronique à balayage de la bobine de cuivre de la patiente 1. (B) Notez le biofilm sur la surface de la bobine supérieure du patient 1. La profondeur de la fissure a révélé la matrice de biofilm enfermée avec des micro-organismes.
(A) Microscopie électronique à balayage de la bobine de cuivre du patient 1. (B) Notez le biofilm sur la surface de la bobine supérieure du patient 1. La profondeur de la fissure a révélé la matrice de biofilm enfermée avec des micro-organismes.
Matrice extracellulaire avec micro-organismes enfouis provenant du patient 1.
Matrice extracellulaire avec micro-organismes intégrés du patient 1.
Microscopie électronique à balayage montrant des preuves de la présence de la levure à la surface du biofilm du patient 1.
Microscopie électronique à balayage montrant des preuves de la présence de la levure à la surface du biofilm du patient 1.
Microscopie électronique à balayage du biofilm formé sur le dispositif intra-utérin du patient 2. Notez le biofilm épais avec un mélange de micro-organismes.
Microscopie électronique à balayage du biofilm formé sur le dispositif intra-utérin de la patiente 2. Notez le biofilm épais avec un mélange de micro-organismes.
Le biofilm épais sur la surface du bobinage supérieur de la patiente 2.
Le biofilm lourd sur la surface du serpentin supérieur du patient 2.
Microscopie électronique à balayage montrant une grande quantité de biofilm complexe avec la levure présente sur la surface du serpentin supérieur du patient 2.
Microscopie électronique à balayage montrant une grande quantité de biofilm complexe avec la levure présente sur la surface du serpentin supérieur du patient 2.
(A) Frottis vaginal à coloration de Gram montrant des levures avec des blastoconidies et des pseudomycéliums de la patiente 1. (B) Levures avec présence de blastoconidies du patient 2.
(A) Frottis vaginal à coloration de Gram montrant des levures avec blastoconidies et pseudomycelium du patient 1. (B) Levures avec présence de blastoconidies du patient 2.
Discussion
Les biofilms sont des agrégats de micro-organismes unicellulaires formant des structures multicellulaires qui adhèrent aux surfaces . Les bactéries et champignons pathogènes peuvent former des biofilms sur les surfaces inertes des dispositifs implantés tels que les cathéters, les valves cardiaques prothétiques et les DIU, et la présence de biofilms peut constituer une source d’infection pour les patients . L’utilisation du stérilet est une méthode très efficace et rentable de prévention de la grossesse. C’est l’une des méthodes de contraception les plus populaires dans le monde aujourd’hui. Toutefois, si des biofilms microbiens se forment à la surface des DIU, ils peuvent favoriser l’infection chez un hôte sensible. La candidose vulvovaginale est une infection fongique extrêmement fréquente qui reste un problème important dans le monde entier. Plusieurs facteurs de risque ont été indiqués en ce qui concerne son étiologie, mais de nombreuses questions subsistent quant aux infections récurrentes concernant sa pathogénie en raison des rechutes après l’arrêt du traitement . La présente étude a analysé la présence d’un biofilm à la surface des DIU comme facteur de risque possible de RVVC et a déterminé les profils de sensibilité des levures isolées chez ces patientes. L’étude a porté sur deux patientes présentant des signes et symptômes cliniques de RVVC et utilisant des DIU comme méthode contraceptive. L’examen de laboratoire des sécrétions vaginales des deux patientes a révélé la présence de Candida albicans (Fig. 9). Le microscope électronique à balayage a révélé la présence d’un biofilm avec un réseau dense et multicouche de cellules de différents micro-organismes noyées dans une matrice cellulaire sur les deux dispositifs intra-utérins. Ces données sont en accord avec celles publiées par Pruthi et al. (2003), qui ont trouvé sur la surface du DIU un consortium de microbes organisés en biofilms . D’autres auteurs qui ont réalisé des tests in vitro ont observé que les cellules de levure peuvent adhérer fortement aux parties du DIU et former des biofilms . Les données de la présente étude suggèrent que la présence de biofilms sur les DIU des patientes a servi de réservoir de levures et a contribué à l’infection récurrente par Candida albicans. Ce fait peut être vérifié par l’observation de levures dans le biofilm par analyse au microscope à balayage électronique, suggérant la possibilité que la majorité de ces micro-organismes étaient présents sur ces surfaces depuis peut-être longtemps. Il convient de noter que l’analyse des images réalisées par microscopie à balayage électronique (Figs. 5 et 6) du patient 2 a révélé un biofilm plus lourd sur la surface du serpentin supérieur par rapport à celui du patient 1. Il est fort probable que l’utilisation prolongée du DIU par la patiente 2 ait contribué à la formation d’une masse plus importante de biofilm. Cet effet a été observé par Pal et al. qui ont analysé la formation du biofilm sur les DIU en fonction de la durée d’utilisation. Ils ont constaté que l’utilisation prolongée des DIU était associée à un risque accru d’infection chronique par des micro-organismes. Les levures adhérentes observées dans les figures 4 et 7 suggèrent que ces micro-organismes présents à la surface du stérilet supérieur peuvent constituer une source d’infection pour les patientes atteintes de candidose vulvo-vaginale.
Ligne 1, marqueur de taille moléculaire 100 pb ; ligne 2, patiente 01, ligne 3, patiente 02 ; ligne 4, contrôle 03, Candida albicans ATCC 90028.
Voie 1, marqueur de taille moléculaire 100 pb ; voie 2, patient 01, voie 3, patient 02 ; voie 4, contrôle 03, Candida albicans ATCC 90028.
Dans la présente étude, trois mois après le retrait du DIU, les patientes sont revenues pour un nouvel examen gynécologique et de laboratoire, qui n’a pas révélé de signes cliniques ou de symptômes évocateurs de RVVC. En outre, les données de laboratoire à ce moment-là étaient négatives pour Candida albicans, ce qui suggère que l’absence du biofilm à la surface du DIU a contribué à l’absence d’infection. Il est important de souligner que, bien que le traitement au fluconazole ait contribué à la guérison, l’absence de la source des micro-organismes contenus dans le biofilm était essentielle pour éviter les rechutes de candidose vulvo-vaginale chez ces patientes.
Dans la présente étude, l’analyse des données a révélé que tous les isolats récupérés étaient sensibles aux deux antifongiques étudiés lorsqu’ils étaient testés dans des conditions de croissance planctonique. La présence du biofilm à la surface du DIU a contribué à protéger les levures de l’action de l’agent antifongique, tout en contribuant à la persistance du micro-organisme, entraînant des infections récurrentes par candidose vulvovaginale.
En conclusion, les biofilms sont une matrice complexe pouvant contenir des micro-organismes formant des structures multicellulaires qui adhèrent à des surfaces solides et peuvent contribuer à la source d’infection des patients.
La présente étude suggère que la présence du biofilm sur la surface du DIU peut constituer un facteur de risque de candidose vulvo-vaginale persistante.
Reconnaissance
Nous tenons à remercier la FAPESP pour son soutien financier.
Déclaration d’intérêt : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt. Les auteurs sont seuls responsables du contenu et de la rédaction de l’article.
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Cet article a été initialement publié en ligne sur Early Online le 7 avril 2009.
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