Biol Res 44:195-199, 2011
La culture prolongée jusqu’au stade du blastocyste : une stratégie pour éviter les grossesses multiples dans les technologies de procréation assistée
Soledad J Sepúlveda, Jimmy R Portella, Luis P Noriega, Ernesto L Escudero & Luis H Noriega
Groupe de procréation assistée de PRANOR.
ABSTRACT
Le but de cette étude était d’examiner l’expérience et les résultats des cycles de reproduction assistée avec des embryons cultivés jusqu’au cinquième jour de développement, en comparant différents paramètres en fonction de l’âge des patients.
Nous avons étudié rétrospectivement 1 874 cycles de reproduction assistée où la culture des embryons a été prolongée jusqu’au cinquième ou sixième jour de développement. Tous les cycles de FIV et d’ICSI ont été inclus, en comparant, en fonction de l’âge des patients, les taux suivants : formation de blastocystes, grossesse, implantation et avortement. Comme contrôle, nous avons analysé les cycles avec des ovocytes donnés par de jeunes donneuses (OD). Le nombre d’embryons atteignant le stade de blastocyste est similaire dans tous les groupes de patientes. Seul le groupe OD était différent en termes de formation de blastocystes, de taux de grossesse et d’implantation. Les patientes de plus de 39 ans avaient un taux d’avortement de 59,1 %, ce qui est significativement plus élevé que les autres groupes.
La culture prolongée d’embryons jusqu’au stade de blastocyste peut être mise en œuvre dans les programmes de procréation assistée afin d’augmenter le taux de grossesse. Le potentiel d’implantation du blastocyste est élevé, ce qui nous permet de transférer moins d’embryons et de réduire la probabilité de grossesses multiples.
Mots clés : blastocyste, culture à long terme, taux de grossesse, taux d’implantation.
INTRODUCTION
Le défi des techniques de procréation assistée (PMA) est d’éviter les grossesses multiples, qui pourraient être causées par le nombre élevé d’embryons transférés. Par conséquent, l’objectif est, espérons-le, de transférer un seul embryon, mais bien sélectionné. En général, les laboratoires de procréation assistée sélectionnent les embryons à transférer en fonction de leur morphologie, car c’est le seul outil simple. Cependant, une bonne morphologie n’est pas toujours liée au résultat de l’embryon et peut impliquer de multiples aneuploïdies.
Dans la dernière décennie, des systèmes de culture ont été développés qui permettent un développement prolongé jusqu’au stade de blastocyste et par la suite la sélection des meilleurs embryons à transférer (Gardner et al., 1998 ; Blake et al., 2007). Cependant, le développement humain précoce est inefficace et seuls quelques zygotes atteindront le stade de blastocyste et l’implantation. Par conséquent, un embryon qui se développe jusqu’au stade de blastocyste subit une sélection spontanée pendant la culture in vitro.
Formation du blastocyste
Après le passage dans le tube, l’embryon est une morula. Dans les blastomères périphériques, il s’établit des jonctions serrées qui scellent l’espace entre les cellules externes qui forment les trophoblastes. L’étanchéité empêche la diffusion de matériel intercellulaire dans l’espace extra-embryonnaire et c’est ainsi que se forme la cavité blastocoel. La morula, composée d’un type unicellulaire, se transforme en blastocyste, où l’on peut reconnaître des types bicellulaires. Les blastomères périphériques forment un épithélium aplati appelé trophoblaste, et les blastomères centraux forment la masse cellulaire interne. Ces cellules donnent naissance à l’embryon lui-même et à une partie des annexes embryonnaires. Le trophoblaste est à l’origine de la plupart des annexes. Le blastocyste humain expansé contient plus de 90 cellules, dont on estime que 10% forment la masse cellulaire interne (figure 1) (Sepúlveda, 2008).
La cavité blastocoel est formée par la confluence de vacuoles. Elle se développe par l’action de la Na+ / K+ ATPase située dans la membrane des cellules du trophoblaste. Les ions Na + pénètrent dans la cavité, qui commence à incorporer de l’eau pour maintenir l’équilibre osmotique. Le mouvement de l’eau pendant la cavitation peut également être facilité par des aquaporines situées dans les membranes apicale et basolatérale du trophectoderme (Barcroft et al., 2003). Ainsi, la cavité se dilate et commence à éclore, après quoi l’embryon adhère à la surface de l’endomètre, envahissant et entrant en contact avec le système vasculaire de la mère lors de l’implantation. Cette procédure peut prendre quelques jours et passe par les étapes illustrées dans la figure 1. Tout d’abord, un blastocyste précoce est formé, avec une petite cavité, qui se développe pour former un blastocyste complet. À partir de ce stade, on commence à catégoriser le nombre de cellules du trophoblaste et de la masse cellulaire interne. L’expansion commence et finalement l’éclosion à travers la zone pellucide (Figure 1). Cette classification permet de sélectionner les blastocystes pour le transfert qui ont un potentiel de croissance plus élevé. La logique derrière la prolongation de la culture de l’embryon jusqu’au cinquième jour n’est pas d’améliorer sa qualité, mais d’augmenter la probabilité de choisir l’embryon avec un meilleur potentiel d’implantation.
Avantages de la culture prolongée au blastocyste
Il est important d’avoir une méthode de sélection des embryons qui permet de transférer le nombre minimum d’embryons sans affecter les chances de grossesse. Le développement de milieux par lesquels les embryons se développent plus longtemps, jusqu’au stade de blastocyste permet de sélectionner les meilleurs embryons à transférer. Ainsi, il a permis d’augmenter les taux d’implantation et de réduire les gestations multiples. Une méta-analyse, qui a évalué 18 études contrôlées randomisées, a rapporté qu’il existe une différence significative dans les taux de grossesse et de naissances vivantes pour les transferts au jour 5 par rapport aux transferts au jour 3 (Blake et al., 2007).
L’idée que les milieux séquentiels sont nécessaires pour un développement optimal des embryons a un attrait intuitif, mais elle n’est pas soutenue par des preuves expérimentales directes (Biggers et al., 2005). Dans de tels systèmes de culture de milieux séquentiels, le milieu utilisé pour la culture des embryons du jour 1 à 3 du développement diffère dans sa composition et/ou sa concentration en composants du milieu utilisé pour la culture ultérieure du jour 3 au stade de blastocyste (Gardner & Lane, 1997, 1998). Nous avons démontré que le développement in-vitro jusqu’au stade de blastocyste et les taux d’implantation ultérieurs sont meilleurs pour les embryons humains cultivés dans un milieu unique que pour ceux cultivés dans un système de milieux séquentiels (Sepúlveda et al., 2009). La fécondation ne se produit pas au même moment dans tous les œufs, et le moment de l’implantation de chaque embryon est donc différent. Par conséquent, un seul milieu serait préférable, où l’embryon utilise ce dont il a besoin.
Il existe plusieurs avantages pour la culture jusqu’au stade de blastocyste. Comme nous l’avons vu précédemment, la culture à plus long terme nous permet de distinguer les embryons viables ayant le plus grand potentiel d’implantation de ceux qui se sont développés initialement mais qui meurent plus tard. Elle permet également d’évaluer l’activation génomique de l’embryon (Braude et al., 1988), en recherchant les embryons qui n’atteignent pas le stade de 8 cellules. Des données montrent que le taux d’avortement précoce est plus faible lorsque les blastocystes sont transférés (Papanikolaou et al, 2006).
In vivo, les embryons au stade de clivage se trouvent généralement dans les trompes de Fallope, et non dans l’utérus, ce qui explique pourquoi la synchronisation du transfert des embryons au stade de blastocyste avec l’environnement utérin est plus physiologique (Gardner et al., 1996). Un autre avantage de la culture à long terme est le temps prolongé, qui permet le transfert lorsque les blastomères sont prélevés au jour 3 pour le diagnostic génétique préimplantatoire.
Le but de cette étude était de passer en revue l’expérience et les résultats des cycles de reproduction assistée avec des embryons au jour 5 du développement, en comparant divers paramètres en fonction de l’âge du patient.
MATERIELS ET METHODES
Nous avons étudié rétrospectivement 1 874 cycles de procréation assistée où les embryons ont été cultivés jusqu’au cinquième ou sixième jour de développement, y compris les procédures de don d’ovocytes (DO, n = 1 192 ; 2004 – 2010), de fécondation in vitro (FIV) et d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) (n = 682, 2008-2010).
Les taux suivants ont été comparés en fonction de l’âge de la patiente : formation de blastocystes, grossesse, implantation et avortement.
Insémination / injection
Pour l’insémination dans le cadre d’une FIV conventionnelle, environ 100 000 spermatozoïdes ont été co-cultivés avec des complexes cumulus-corona-oocyte. Pour l’ICSI, seuls les ovocytes en métaphase II (MII) ont été injectés, selon les procédures décrites précédemment (Sepúlveda et al., 2009).
Culture d’embryons
Les ovocytes fécondés (2PN) ont été cultivés individuellement dans des gouttes de milieu Global® 10 |UL (Global Life, Canada) complété par 10 % de substitut de sérum synthétique (SSS). Le jour 3, les embryons ont été changés dans un milieu Global® frais. Les cultures étaient sous huile minérale à 37°C dans une atmosphère de 6,5 % CO2, 5 % O2 et 88,5 % N2. Les évaluations du développement embryonnaire ont été réalisées selon les procédures décrites (Sepúlveda et al., 2009).
Transfert d’embryons
Les transferts d’embryons ont été réalisés au jour 5 ou 6 de la culture embryonnaire, à l’aide d’un cathéter Frydman Ultrasoft (Laboratoires CCD, France). Un ou deux embryons ont été sélectionnés pour le transfert. Si plus d’embryons étaient disponibles, ils ont été congelés ou vitrifiés.
Définition des paramètres analysés
Le taux de formation de blastocystes est le nombre total de blastocystes parmi le total des ovocytes 2PN. Le taux de grossesse a été défini comme le nombre de cycles avec au moins un sac gestationnel parmi le nombre de cycles transférés. Le taux d’avortement a été défini comme le nombre de grossesses avec perte totale des sacs gestationnels avant 20 semaines de gestation parmi le nombre de grossesses. Le taux d’implantation a été calculé en fonction du nombre de sacs gestationnels parmi le nombre total d’embryons transférés.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du progiciel statistique STATA 10.0 (StataCorp LP, 4905 Lakeway Drive, College Station, TX, USA). La normalité de la distribution des variables continues a été évaluée avec un test de Kolmogorov-Smirnov. Les variables continues ont été évaluées à l’aide de statistiques paramétriques (test t de Student) ou non paramétriques (test de la somme des rangs de Mann-Whitney). Pour les variables non continues, le test du chi-deux ou le test exact de Fisher a été utilisé. Les différences ont été considérées comme significatives avec une valeur p de <0,05.
RESULTATS ET DISCUSSION
Dans le programme de don d’ovocytes, les cultures de blastocystes ont commencé en 2004 avec 4 % des cycles. Actuellement, la culture étendue jusqu’au stade de blastocyste est devenue une technique de routine, survenant dans 90 % des cas en 2010 (figure 2).
Le tableau 1 décrit les 4 groupes qui ont été comparés. Les patientes de moins de 35 ans, les patientes âgées de 34 à 39 ans, les patientes de plus de 39 ans et les patientes ayant reçu des ovocytes de jeunes donneuses (DO). Le nombre d’ovocytes obtenus lors de l’aspiration folliculaire, comme prévu, diminuait avec l’âge. La proportion de cycles où l’ICSI a été utilisée comme méthode d’insémination était similaire dans tous les groupes (tableau 1).
Le nombre d’embryons atteignant le stade de blastocyste était similaire dans les trois groupes de patients avec une tendance à diminuer en fonction de l’âge. Cependant, lorsque l’ovocyte appartenait à une donneuse (DO), le taux de formation de blastocystes augmentait de plus de 40 % (p< 0,05). Ce taux était de 40 % chez les jeunes patientes et de 34 % seulement chez les patientes plus âgées (tableau 2). Contrairement à nos résultats, Thomas et al. (2010) ont rapporté que l’âge des patientes était négativement associé à la formation de blastocystes. De même, le pourcentage d’embryons cryoconservés est plus élevé dans le groupe DO et chez les patients de moins de 35 ans que chez les patients de plus de 35 ans (tableau 2).
Le pourcentage de cycles avec transferts annulés était d’environ 15 % chez les patients de plus de 34 ans (figure 3). Les annulations pourraient être dues au faible nombre d’ovocytes obtenus lors du prélèvement d’ovules, ce qui conduit à moins ou pas d’embryons disponibles, par rapport au prélèvement chez des femmes plus jeunes. Cependant, certains rapports ont montré que le transfert de blastocyste peut être applicable à n’importe quelle patiente sans compromettre la probabilité de transfert d’embryon ou de grossesse (Marek et al., 1999 ; Wilson et al., 2002).
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Le taux de grossesse varie selon l’âge des patientes : 48.4 % pour les femmes de moins de 35 ans et 38,6 % pour les femmes de plus de 39 ans (figure 4). Lorsque les cycles ont été réalisés avec des dons d’ovocytes de femme jeune, le taux de grossesse est passé à 58,1 %, une valeur supérieure à celle de tous les groupes de patientes (p <0,005).
Dans cette étude, le nombre maximum d’embryons transférés était de deux, ce qui est notre politique depuis 2004 afin d’éviter le risque de grossesses multiples. Le taux élevé d’implantation montré dans tous les groupes reflète le potentiel d’implantation plus élevé des embryons transférés au cinquième jour (Figure 4), également montré par d’autres études (Gardner et al., 1998 ; Blake et al., 2007). Cependant, le taux d’implantation est plus faible chez les patientes que dans le groupe DO. Cela peut s’expliquer par des facteurs supplémentaires liés à la cause de l’infertilité chez les patientes (Marino et al., 2011), puisque les donneuses d’ovules sont des femmes jeunes sans problème apparent de reproduction. De plus, il existe des preuves de changements sévères dans le développement de l’endomètre lors des cycles stimulés (Haouzi et al., 2010). Cela peut être bénéfique pour les receveuses du groupe OD car elles n’ont pas été stimulées.
Bien que le taux de grossesse des patientes plus âgées soit élevé avec le transfert de blastocystes, le taux d’avortement est de 59,1 %, ce qui est significativement plus élevé que les taux des autres groupes (Figure 5).
Cette étude, comme d’autres, a montré un déclin de la fertilité pour les femmes de plus de 35 ans (Van Noord-Zaadstra et al, 1991 ; Perheentupa & Huhtaniemi, 2099), qui est significativement plus faible que le déclin chez les femmes de plus de 40 ans (Marcus & Brinsden, 1996). D’autre part, la plus faible probabilité d’obtenir une grossesse réussie liée à l’augmentation de l’âge maternel est caractérisée par une plus grande prévalence d’anomalies chromosomiques dans l’ovocyte qui conduisent finalement à une réduction significative des taux d’implantation (Munné, 2002) et à des taux élevés d’avortement spontané (Munné et al., 1995 ; Nybo-Andersen et al, 2000).
CONCLUSIONS
La culture embryonnaire prolongée jusqu’au stade du blastocyste peut être mise en œuvre dans un programme de procréation assistée afin d’augmenter la probabilité de grossesse chez les patientes, car une sélection naturelle peut se produire pendant la culture des embryons.
Le potentiel d’implantation du blastocyste est élevé, ce qui nous permet de transférer moins d’embryons et de réduire la probabilité de grossesses multiples. La culture de blastocystes est une alternative qui permet de choisir un seul embryon à transférer chez les femmes jeunes.
Le taux d’annulation est plus élevé chez les patientes de plus de 35 ans, peut-être en raison de la diminution de la réserve ovarienne et du nombre inférieur d’ovocytes obtenus, sachant que les embryons atteignent le stade de blastocyste quel que soit l’âge de la patiente.
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