Comment concevoir une amorce

Conception d’une amorce pour la PCR

Les amorces oligonucléotidiques sont nécessaires lors de l’exécution d’une réaction de PCR. Il faut concevoir des amorces qui sont complémentaires de la région matrice de l’ADN. Elles sont synthétisées chimiquement en joignant des nucléotides ensemble. Il faut bloquer et débloquer sélectivement et de manière répétée les groupes réactifs sur un nucléotide lors de l’ajout d’un nucléotide à la fois. La principale propriété des amorces est qu’elles doivent correspondre aux séquences de la molécule matrice (elles doivent être complémentaires du brin matrice). Cependant, il n’est pas nécessaire que les amorces correspondent complètement au brin de la matrice ; il est toutefois essentiel que l’extrémité 3′ de l’amorce corresponde complètement au brin d’ADN de la matrice pour que l’élongation puisse se poursuivre. Habituellement, une guanine ou une cytosine est utilisée à l’extrémité 3′, et l’extrémité 5′ de l’amorce comporte généralement des tronçons de plusieurs nucléotides. De plus, les deux extrémités 3′ des amorces hybridées doivent pointer l’une vers l’autre.

La taille de l’amorce est également très importante. Les amorces courtes sont principalement utilisées pour amplifier un petit fragment simple d’ADN. En revanche, une amorce longue est utilisée pour amplifier un échantillon d’ADN génomique eucaryote. Cependant, une amorce ne doit pas être trop longue (> amorces de 30-mer) ou trop courte. Les amorces courtes produisent un produit d’amplification de l’ADN imprécis et non spécifique, et les amorces longues entraînent un taux d’hybridation plus lent. En moyenne, le fragment d’ADN qui doit être amplifié doit avoir une taille comprise entre 1 et 10 kB.

La structure de l’amorce doit être relativement simple et ne pas contenir de structure secondaire interne pour éviter le repliement interne. Il faut également éviter l’annelage amorce-amorce qui crée des dimères d’amorce et perturbe le processus d’amplification. Lors de la conception, si l’on ne sait pas quel nucléotide placer à une certaine position dans l’amorce, on peut inclure plus d’un nucléotide à cette position, ce que l’on appelle un site mixte. On peut également utiliser un insert moléculaire à base de nucléotide (inosine) au lieu d’un nucléotide ordinaire pour des capacités d’appariement plus larges.

En tenant compte des informations ci-dessus, les amorces doivent généralement présenter les propriétés suivantes :

• Longueur de 18-24 bases
• Teneur en G/C de 40-60%
• Début et fin avec 1-2 paires G/C
• Température de fusion (Tm) de 50-.60°C
• Les paires d’amorces doivent avoir une Tm à moins de 5°C l’une de l’autre

• Les paires d’amorces ne doivent pas avoir de régions complémentaires

  Note : Si vous allez inclure un site de restriction à l’extrémité 5′ de votre amorce, notez qu’un « clamp » de 3 à 6 paires de bases doit être ajouté en amont afin que l’enzyme puisse se cliver efficacement (par ex.par exemple, GCGGCG-site de restriction-votre séquence).

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